Способ получения антибиотика

пп 470964 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Соаз Советских Социалистивских Республик(ЗЗ) США осударственныи комите авета йтинистрав СССР оо делам изобретений юллетень18 Опубликовано К 615 779 9тиры Дата опубликования описания 11.09.75 72) Авторы изобретения оберт Л, Хам Иностранцыил и Марвин Ма(США)ностранная фирмаЛилли энд Компани(США) н 71) Заявите 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИ Изобретение относится к области получения антибиотиков.Предложенный способ получения антибиотика (АА), ранее в патентной литературе не описанный, заключается в том, что культуру Ягер 1 отпусез саргео 1 цз МКК 1. 3817 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30 - 50 С и рН б,2 - 7,2 в течение 72 в 1 ч. Фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом при рН 8,5, экстракт упаривают досуха. Остаток обрабатывают метанолом, мета нольный экстракт упаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе, хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок растворяют в хлороформе, пропускают раствор через колонку адсорбента, например силикагеля, элюируют целевой продукт ацетоном с последующим выделением известными приемами.Предложенный штамм Ягер 1 огпусез саргео 1 цз ИКК 1. выделен из образца почвы, собранной в Венесуэле, имеет гладкие споры овальной или почти цилиндрической формы, расположенные в виде длинных извилистых переплетенных цепей, в количестве приблизительно 10 - 50 спор на одну цепь.Предложенный штамм имеет следующие особенности на различных питательных средах. Цвета определяют по Маегга и Рац 1,М. К., 1.т 1 с 11 опагу о 1 Со 1 ог, Чс бган-1111. Хеж 1 огс (1950).Агар с томатной пастой и овсян о й к а ш е й. Хороший рост с недостаточ ным воздушным мицелием (белый), субстрат.ный зшцелий имест цвет серовато-желтовато- коричневый 13 В 5. Растворимый пигментотсутствует.А г а р ь 1 а п с к а. Хороший рост с недоста точным воздушным мицелием. Субстратныймицелш бледно-желтьш 10 В 2.Агар с дрожжевым экстрактом.Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия или спор. Субстратный мицелий ин тенсивно желтовато-ярко-розовый 2 Г 9.Растворимый пигмент отсутствует.А г а р В е и и е 11. Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия. Субстратный мицелий умеренно красный 3 Н 10. Раство римый пигмент отсутствует.Питательный агар. Довольно хороший рост при отсутствии воздушного мицелия или спор.Агар Э мер сон а. Хороший рост прп от сутствии воздушного мицелпя. Субстратныймицелий темный серотселтый 13 К 3. Растворимый пигмент отсутствует.Агар с глюкозой и асп ар агином.Хороший рост при отсутствии мицелия. Суб стратньш мицелий интенсивно желтовато-яр5 10 15 20 25 30 засевают 15 15 35 5 2 5 1 л 40 45 50 55 60 65 ко-розовый, Растворимый пигмент отсутствует.Агар с малатом кальция (кальциевой солью яблочной кислоты). Рост на этой среде был настолько скудный, что це было сделано никаких наблюдении цвета.Агар с тпрозппом. Довольно хороший рост со скудным воздушным мицелием и бледно-желтыми спорами 1 С 1, Субстратный мицелий бледно-желто-зеленый. Растворимый пигмент отсутствует.Среда Международный проек г 1 ЯР гпес 11 пгп2. Обильный рост при отсутствии воздушного мицелия или спор. Субстратный мицелий сероватый и красновато-оранжевый 11 А 8). Растворимый пигмент отсутствует,Среда Международный проект 1 Я Р пл е (1 1 п гп3. Довольно хороший рост с довольно хорошим воздушным мицелисм и спорами, Цвет серовато-желтоватый, ярко-розовый 4 А 9. Растворимый пигмент от. сутствует.С реда Международный пр оект 15 Р гп е г 11 ц гп4. Скудный рост со скудным воздушным мицелцем и спорами, Субстратпый мицелий бледно-желто-зеленый 1 О В 1. Растворимый пигмент отсутствует.Среда Международный проект 18 Р гпс с 11 п гп5. Рост этой среды был настоо ничтожен, что пе было отмечено проявление цвета.М(елатин - не разжижает. Восстанавливает нитраты. 11 а агаре с келезом и пептоннодрокжевым экстрактом и на мясном отваре с триптоном и дрожжевым экстрактом меланинового пигмента не образует.Полученный предложенным способом антибиотик АА представляет собой белое кристаллическое соединение, плавящееся при70 - 172 С, при выкристаллизовывании из :.цетопа. Оно очень хорошо растворяется в спиртах, растворимо в ацетоне, хлороформе и этилацетате, нерастворимо в воде, углеводородах и простом эфире.Электрометрическое титрование АА в 67%-ном диметилформамиде показало первоначальное значение рН 7,8 и не обнаружило титрующихся групп в пределах рН от 3,5 до13,5.Микроанализ ом получен следующий примерный элементарный состав АА, %: С 55,20; Н 6,72; М 10,45; О 28,05, молекулярньш вес на основе масс-спектрального исследования составляет около 693,Инфракрасный спектр АА, как кристаллического соединения в хлороформном растворе показан на чертеже, Распознаваемые полосы в инфракрасном спектре поглощения в пределах 2,0 - 15,0 мкм: 2,96 (широкая); 3,45; 3,53; 5,89; 6,06; 6,26; 6,33; 6,40;6,67; 6,92; 7,06; 7,15; 7,28; 7,46; 7,60; 7,76; 7,92;8,10; 8,30; 8,60; 8,87; 9,06; 9,14; 9,32; 9,54; 9,65;10,2; 10,23; 10,59; 11,01; 11,30; 11,60 и 12,00. Спектр поглощения в ультрафиолетовых лучах АА в 95%-ном этаноле: водный раствор показывает максимум поглощения примерно при 208 мкм, с коэффициентом экстинкции Е,= 535 и максимум поглощения примерно при 275 мкм с коэффициентом экстинкции Е с"м -- 490.Антибиотик АА обладает тчло активностью в отношении заражения цыплят Мусор 1 аипа Ра 11 Ыор 1 сцгп,При введении через рот (перорально) дозами 100 мг/кг смесь антибиотиков АА эффективна при воздействии на молодых крыс, зараженных Еп 1 апоеба пЫо 1 ц 1 са.Антибиотик АА при подкожной инъекции мышам обладает 1 пчжо антимикробной активностью против инфекционных организмов.Антибиотик АА является также эффективным средством для торможения роста микроорганизмов, которые содействуют развитию периодонтального заболевания.П р и м ер 1. Штамм Ягер 1 огпусез саргео 1 цз ККК. 3817 выращивают 6 дней при 30 С на питательном косом агаре следующего состава, г:Глюкоза 5 Дрожжевой экстракт 10 Агар 20 Дистиллированная вода до 1 л Суспензией, смытой с косяков, 100 мл среды следующего состава, гДекстрозаМука соевых бобовТвердый водный экстрактзерен пшеницы или кукурузыСаСОзИаС 1Вода водопроводная до до Инкубацию проводят 48 ч при 30 С при непрерывном встряхивании на вращающемся устройстве, работающем со скоростью 250 об/мин.Порции по 100 мл среды того же состава, что и вышеуказанный, помещают в Эрленмейеровские колбы емкостью 500 мл, подвергают стерилизации при 120 С в течение 30 мин и засевают полученной культурой.Культивирование проводят при встряхивании в течение 72 ч при 30 С на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем 250 об/мин, рН привитой среды приблизительно 7,. рН постепенно возрастает на протяжении периода времени брожения и при снятии урожая составляет около 7,5. Антибиотик экстрагируют из культуральной жидкости общеизвестными приемами.П р и мер 2. Спорами Ягер 1 огпусез саргео 1 цэ ККК. 3817 засевают питательный косой агар следующего состава, г:Глюкоза 5Дрожжевой экстракт 10470964 15 10 10 10510 вода до 1 л ДекстрозаБактопентонГлицеринАмбер, А 1.ВПатокаНадрисолДистиллированная 0,02 5,00 1,50 0,30 0,25 100,0 50 55Ферментацию проводят в течение 48 ч при30 С при скорости перемешивания около250 об/мин и аэрации с расходом396,4 дм/мин. За этот отрезок времени добавляют стерильный раствор из 472 кг декст- борозы в 42 л воды. Ферментацию продолжаюти последующие 48 ч,900 л культуральной жидкости, полученной,как указано выше, фильтруют с использованием 27 кг коммерческого вспомогательно, о 65 Агар 20 Дистиллированная вода до 1 лПривитой косой агар выдерживают в термостате при 30 С в течение 5 дней.0,5 мл смытой с косяка суспензией засевают 50 мл стерильной среды следующего состава, г: Амбер (АгпЬег) А 1.В - торговое название для продукта молочного альбумина лаборатории АгпЬег, Зцпсап, Висконзин 55039.Надрисол (Мадг 1 зо 1) - торговое название высушенного растворимого продукта винокуренного производства фирмы Ма 11 опа 1 РЫ 11- 1 егз Ргос 1 цс 1 з Сотрапу, Нью-Иорк.Инкубацию проводят 72 ч при 72 С при постоянном перемешивании на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем 250 об/мин,Порцию в 20 мл полученной таким образом культуральной жидкости добавляют к 400 мл среды того же состава, что и приведенная выше. Выращивание ведут в теченис 48 ч при 30 С при постоянном перемешивании на вращающемся встряхивающем устройстве, совершающем 250 об/мин.К ферментационному резервуару добавляют после стерилизации при 120"С 42 л среды из семян вышеуказанного состава с добавлением 0,2 г противовспенивающего средства на 1 л среды. В среду из семян добавляют около 400 мл полученной культуральной жидкости и культивируют около 24 ч при 30 С при перемешивании мешалкой, вращающейся со скоростью 135 об/мин, и аэрации с расходом 18,4 дм/мин. Спустя примерно 24 ч ферментации около 8,0 л культуры используют для прививки 946,25 л стерильной продукционной среды, содержащей, . Противовспенивающий агентДекстрозаКрупа соевых бобовПатока (черная меляса)Карбонат кальцияДистиллированная вода до 5 10 15 20 25 30 35 40 45 6фильтра (11 цйо Ьцрег-се 1). Фильтрат доводят до рН 8,5 с помощью 5 н. раствора гидроокиси натрия. Щелочной фильтрат дважды экстрагируют, используя 0,5 объема хлороформа, Хлороформные вытяжки собирают и выпаривают досуха под вакуумом. Образующийся остаток растворяют в 2 л метанола, а нерастворимые частички отфильтровывают и отбрасывают за ненадобностью. Фильтрат метанола,вьшаривают досуха под вакуумом. Образующийся остаток растворяют в 470 мл хлороформа и добавляют к 10 л петролейного эфира. При этой операции образовывается осадок. Осадок отфильтровывают, затем сушат под вакуумом с выходом 82,6 г сырьевой смеси антибиотика.В 500 мл хлороформа растворяют 3 г сырьевой смеси антибиотика, полученной по вышеприведенному способу. Хроматографическую колонку размерами 7)(60 см набива 1 от кремнегелем 1 огасе,62, 1 Эах 1 воп С 1 чеп 11 са 1 Со), измельченным со смесью хлороформа и ацетона (1: 1), а затем растворитель удаляют. Хлороформный раствор сырьевой смеси антибиотика вводят в верхнюю часть колонки и пропускают через слой кремнегеля.После выхода 500 мл хлороформа из колонки слой силикагеля промывают 10 л смеси хлороформа и ацетона (1; 1). Сточную и промывочную жидкость отбрасывают за ненадобностью,После этого через колонку пропускают ацетон и элюат (экстракт из адсорбента), испытывают на активность антибиотика. Фракции, имеющие активность антибиотиков, собирают и выпаривают досуха под вакуумом. К полученному таким образом остатку добавляют 500 мл ацетона. Раствор нагревают, а затем дают ему 10 - 12 ч постоять при - 20 С для обеспечения протекания кристаллизации антибиотика АЛ. Кристаллы отфильтровывают и высушивают под вакуумом, выход при этом составляет 13,3 г антибиотика АА с т. пл.170 в 1 С,Проводя элюирование антибиотика АА, смесь ацетона и метанола (9: 1) пропускают через колонку и удаляют фракциями, которые испытывались на активность антибиотика. Пред и ет изобретенияСпособ получения антибиотика, о тл и ч ающийся тем, что культуру Йгер 1 оптусез саргео 1 цз 1 хКК 1. 3817 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 30 - 50 С и рН 6,2 - 7,2 в течение 72 в 1 ч, фильтрат культуральной жидкости экстрагируют хлороформом, метанольный экстракт упаривают досуха, остаток растворяют в хлороформе, хлороформный раствор вливают в петролейный эфир, осадок растворяют в хлороформе, пропускаю г раствор через колонку адсорбента, например силикагеля, элюируют целевой продукт ацетоном с последуощим выделением известными приемами.470964 Редактор Т. ДевятЗаказ 2206/4ЦНИИП раж 529 Подписноета Министров СССРрытий, д. 4/5 Изд. Мо 1502 ТИ Государственного комитета Сов по делам изобретений и отк Москва, Ж-З 5, Раушская наб Типография, пр. Сапунова Я 4000 5000 2500 2000 ц м 60 ф 40 3 200 Частота, и1500 14 ОО 1500 1200 1100 1000950 900 850 ВОО 750 700 б 9 10 11 12 13 14 15тмщ анас, ти оставитель С. ЩеневаТехред Е, Подурушина Корректор Е. Рогайлина