Способ консервирования эмбрионов млекопитающих

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 18 А 9) 01 Й 10 ГОСУДАРСТВЕН ЮЕ ПАТЕНВЕДОМСТВО СССРП Т НТ СССР фОС АЕ )ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К АВТОРСКОМУ С ЛЬСТВ 1(71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР(72) В.И;Грищенко, Н.А.Лучко, В.И.Загнойко, С.Г.Колаева и Л.И.Крамарова (56) Авторское свидетельство СССР )Ф 1737783; кл. А 01 й 1/02, 1991. (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРЙОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Изобретение относится к криобиологии.и может быть исйользовано в экспериментальной репродуктологии.Целью изобретения является удлинение сроков хранения эмбрионов.Поставленная цель достигается тем, что среде консервирования вмято химического протектора. моноэтилового эфира глицерина испбльзуют биологический - низкомолекулярную (1-10 кД) фракцию.эпителия тонкого кишечника. зимоспящего суслика в концентрации 0,12-0,20 гр/л среды.Выделение фракции производили по из-: вестной, методике (3): на первом этапе ацетоновый: гомогенат: ткани цетрифугировали в течение 30 мин при ЗОВ)д, осадок лиофилизировали в М уксусной:кислоте и центрифугировали 1 час при 40009 Полученный центрифугат подвергали последовательно ультрафильтрации через фильтры Халипор.-4 (Эстония) и ОМ(Ап)соп-ОЗА). Получали фракцию молекулярной массы 1-10 кО. После ультрафильт(57) Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - удлинение сроков хранения эмбрионов, Эмбрионы помещают в среду Дьюльбекко, содержащую 10-ную сыворотку плодов коров и охлаждают до 50 С. Затем добавляют охлажденную до 5 фракцию эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика молекулярной массы 1- 10 кД до концентрации 0,12-0;20 г/л среды и хранят при 5 С трое суток. 5 табл. рации материал лиофилизировали и хранили в герметичных ампулах при -20 С.П р и м е р 1. Эмбрионы мышей на стадии морулц вымывали при комнатной температуре средой Дюьльбекко (4), содержащей 10-ную эмбриональную сыворотку й коров. На этой же среде готовили фракцию ( эпителия тонкого кишечника (ФЭ) зимоспящего суслика с добавлением эмбриональ- д ной сыворотки.40 эмбрионов разделили на две группы по 20 эмбрионов в каждой. Эмбрионы каж аай дой группы помещали в стеклянную ампулу, Ю содержащую 0,5 мл среды Дюльбекко и 10 эмбриональной сыворотки, Ампулы с эмбрионами первой опытной группы охлаждали а ступенчато от комнатной (+20 С) температу- ры+50 С, понижая температуру на 5, и выдерживали при данной температуре в течение 5 мии. Аналогично охлаждали 0,5 мл фракции (1-10 кР), выделенной из эпителия . тонкого кишечника зимоспящего суслика.рН ФЭ бцл в пределах рН среды Дюльбекко с добавкой 10-ной эмбриональнойсыворотки, ФЗ капельно добавляли в соотношении 1:1 к охлажденным эмбрионам. Конечная концентрация ФЭ составляла 0,12,г/л. После герметизации ампулы хранилипри 5 С в течение 24, 48 и 72 часов. К эмбрионам второй, контрольной группы добавляли при комнатной температуре средуДюльбекко, содержащую 10-ную эмбриональную сыворотку, ступенчато охлаждалиот комнатной температуры до 5 С, понижаятемпературу на 5 С и выдерживая при нейв течение 5 мин, После этого охлажденныеэмбрионы ступенчато отогревали на водяной бане, повышая температуру на 5 каж. дые 5 мин, Затем эмбрионы при комнатнойтемпературе переносили в культуральнуюсреду Виттена, где культивировали в течение 24 часов до выхода в бластоцисту (5),Сохранность эмбрионов контрольной группы составила 97,8.Эмбрионы опытной группы после хранения в герметически закрытых ампулахступенчато отогревали в водяной бане, повышая температуру на 5 и выдерживая прикаждой по 5 мин. Ампулы вскрывали стерильно и отмывали от ФЭ трехступенчато,добавляя к одной капле исходного раствора10 капель среды Дюльбекко с эмбриональной сывороткой через каждые 3 мин. Послеэтого эмбрионы опытной группы выдерживали 10 мин в культуральной среде и проводили культивирование в среде Виттена ватмосфере тройного газа(5 ь С 02,90 ф Н 2 и5 02) при 37 С в течение 24 часов до выхода в бластоцисту, Эмбрионы опытной группы развивались подобно контрольной. Втабл,1 представлена сохранность эмбрионов после различных сроков хранения, результаты в сравнении с прототипом.Из табл 1 следует, что заявляемый.способ позволяет хранить эмбрионы на 1 суткидольше без снижения их сохранности,П р и м е р 2. Способ осуществлялианалогично примеру 1, за исключением того, что среда хранения содержала различные концентрации ФЭ, Во всех случаяхсохранность эмбрионов определяли по ихразвитию а культуре до стадии бластоцисты.Результаты представлены в табл.2,Из табл, 2 видно, что наилучшие результаты достигаются при использовании ФЗ вконцентрации 0,12-0,20 гл среды.П р и м е р 3, Способ осуществлялианалогично примеру 1, за исключением того, что среда хранения содержали ФЭ с различной молекулярной массой. Результатыпредставлены в табл,З.Из табл.З видно, что высокую сохранность эмбрионов обеспечивает ФЭ молекулярной массы 1-10 кО. П р и м е р 4. Способ осуществлялианалогично примеру 1, за исключением того, что в среде хранения испольэовали ФЗсусликов Стецз ипсоатцз не в период5 спячки, а в период бодрствования. Результаты представлены в табл.4.Из табл.4 видно, что при использованиив среде ФЗ, полученной у сусликов в периодбодрствования, сохранность резко снижа 10 ется.П р и м е р 5. Изучали влияние ФЭмолекулярной массы 1-10 кО на угнетениебиосинтеэа белка при гипотермической хранении и степень его последующего восста,15 новления,Первую группу, содержащую 10 эмбри-онов, после вымывания помещали в средуДюльбекко с содержанием 10 -ной эмбриональной сыворотки и проводили изотоп 20 ный анализ. Эта группа была контрольной.Вторая группа; содержащая также 10 эмбрионов в среде Дюльбекко с эмбриональнойсывороткой была контрольной по отношению к эмбрионам, хранившимся 24, 48 и 7225 ч в среде, содержащей ФЭ.Стеклянные ампулы заполняли 0,5 млсреды Дюльбекко с 10-ной эмбриональной сывороткой, после чего вносили эмбрионы.ЗО Ампулы с эмбрионами ступенчато охлаждали от комнатной температуры (+20 С)до +5 С с выдержкой при данной температуре в течение 5 мин. Охлаждение 0,5 мл ФЭпроводили аналогично, При +5 С в ампулу с35 эмбрионами капельно в соотношении 1;1добавляли 0,25 мг/л ФЭ. После отогрева наводяной бане и удаления ФЭ осуществляли, изотопный анализ сразу и после дополнительного культивирования в среде Виттена40 при 37 С в атмосфере тройного газа (5)СО 2, 5% 02, 90 М 2). Проведение анализаосуществляли следующим образом. Эмбрионы (10 шт) помещали в 0,5 мл среды ВЗМ(5), содержащей ЗН - лейцин (в дозе 10 мккИ,45 радиоактивность 1 мКи, ЧССР) и инкубировали при 37 С в течение 3 часов, Затем промывали холодной средой, содержащейлейцин. Разрушали эмбрионы путем 10 кратного их замораживания и оттаивания.50 Осаждение белков осуществляли при +4 Спутем добавления 2 мл холодного ТХУ ипоследующего помещения на лед на 15 мин,Белки, осажденные на фильтрах, промывали 5 мл .холодного 70-ного спирта. Для55 окончательного высушивания фильтров ихвыдерживали 10 мин при 50 С, Активностьбиосинтеза определяли с помощью счетчи. ка, помещая фильтр в 14 мл жидкого сцинтиллятора. В табл,5 приведены результатыопытов.1821118 Таблица 1 Таблица 2 Результаты, приведенные в табл. 5, свидетельствуют о полном восстановлении биосинтеза белка эмбрионов в культуре после гипотермического хранения в течение 24,48 и 72 часов.Заявляемый способ консервирования позволяет хранить эмбрионы млекопитающих в течение 72 часов в среде, не содержащей химических агентов, что исключает генетическое изменение эмбрионов в процессе их развития. Формула из обре те н и я Способ консервирования эмбрионовмлекопитающих, включающий экспозицию их при 5 ОС в среде Дюльбекко содержащей 5 эмбриональную сыворотку плодов коров ипротектор, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью удлинения сроков хранения эмбрионов, в качестве протектора используют Фракцию эпителия тонкого кишечника зи моспящего суслика молмас,1-10 кД в концентрации 0,12-0,20 г/л среды.1821118 Таблица 4 Таблица 5 орректор М,Керецман тор П а, 101 ственн аказ 2074 ВНИИП Составитель Л.ФоменкоТехред М,Моргентал Тираж, Подписноеудэрственного комитета по изобретениям и открытиям ври ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-.ЗЬ, Рэушская наб.; 4/5 дательскийкомбинат "Патент", г Ужгород, ул. Г