Способ отделения составной части hdl-холестеринсодержащей жидкости

(19) (11) 33/ 151)5 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИПАТЕНТУ ицина, биохимия. пробу биологичево, состоящее из(54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ СОСТАВНОЙЧАСТИ НО -ХОЛЕСТЕРИНСОДЕРЖАЩЕЙЖИДКОСТИ(57) Использование: медСущность изобретения:ской жидкости на средст Изобретение касается способа и средства для определения НО (липопротеин высокой плотности) в биологических жидкостях.Целью изобретения было устранение недостатков существующего уровня техники и разработка способа выделения биологических жидкостей липопротеинов, кроме НО, который проводится быстро и без дорогостоящих дополнительных устройств, обеспечивает возможность очень быстрого и простого определения Н 01-холестерина,Это достигается за счет извлечения иэ биологических жидкостей липопротеинов, кроме Н 01, путем нанесения биологической жидкости на носитель, который содержит осаждающее средство для всех липопротеинов, кроме НООсаждение завершается в течение менее 1 мин. В качестве носителей, пропускающих жидкость, можно использовать бумагиткани из синтетических волокон (например, полиэфирных и полиамидных), ткадвух носителей, содержащих осаждающее вещество для всех липоп ротеинов кроме НО, Жидкость, прошедшая через носитель, содержит НО -холестерин, В качестве носителя возможно использовать бумагу и синтетические волокна с диаметром плетения 3 - 100 рм и толщиной 0,03 0 - О, 150 мл или стеклянных волокон, а также возможно использование гидрофильных мембран толщиной 20-250,им и диаметром пор 0,2-20 рм. При этом второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диаметром плетения 0,5-5,0 рми влагоемкостью 250-500 г/м, 2 з,п. и ф-лы, 1 табл. ни из натуральных волокон (хлопка, шелка или смесей этих материалов), При этом тка- Б ни могут быть сотканы из моно- или комплексных нитей; предпочтительны ткани из комплексных нитей, Свое преимущество показали волокна, из которых собирается но- р ситель, проницаемый для жидкости, с диаметром волокон от 3 до 100,им, предпочтительно, от 5 до 50,им. Вес 1 м носителя, в частности, составляет от 10 до 100 г/м 2, предпочтительно, от 10 до 50 г/м при толщине от 0,030 до 0,150 мм, влагоемкость составляет от 25 до 100 г/м 2. предпочти- . фу, тельно, от 40 до 70 г/м, при указаннойф выше толщине. Другими подходящими носителями являются структуры; проницаемые для жидкостй, из стеклянных волокон или смесей стеклянных волокон с вышеуказанными волокнами, преимущественно, в нетканой форме, и мембраны с различным исполнением. Мембраны должны обладать гидрофильными свойствами, толщина их 20 - 250 рм, предпочтительно 70 - 150 /1 м, идиаметром пор 0,2-20,им, предпочтительно, 5-15 рм, Перенос жидкости в этих носителях осуществляется с помощью капиллярных сил.Осаждающие средства наносятся нэ носитель, предпочтительно, путем пропитывания носителя раствором, эмульсией или суспенэией осаждаемого средства и последующей сушки, При этом могут быть нанесены также еще и другие полезные добавки, как буферные вещества, поддерживающие рН, или смачивэющие вещества, В такой структуре в качестве осаждающих средств пригодны все химические соединения, которые используются для осаждения липопротеинов в растворе, поскольку они достаточно быстро растворяются в жидкости пробы, Особенно известны определенные полиан ионы в комбинации с двухвалентными.катионами. К ним принадлежат, например, комбинации из фосфовольфрамовой кислоты и хлористого магния, гепарина и хлоридэ двухвалентного марганца, или сульфата декстрана и хлорида магния, Следует заметить, что принципиально, каждый из полианионоа может взаимодействовать с кажгдым из трех катионов(Му илиМп или Са )вследствиечего получается несколько различная способность осаждения липопротеинов кроме НО.,Для целенаправленного осаждения липопротеиноа, кроме НО 1 должна быть соответственно подобрана концентрация выбранного катиона, Размер молекул используемого полианиона также влияет нэ способность осаждения липопротеинов и должен приниматься во внимание, при выборе концентрации. Например, известно применение сульфата декстрина с молекулярным весом равным 500000 и 50000, Оба пригодны также для носителей, проницаемых для жидкостей, однако предпочтение отдается сульфату декстрина с молекулярным весом 50000 в комбинации с Мц +, причем Мпг" снова наносится, преимущество, а форме ацетата магния. Однако должны быть использованы, главным образом, также магний сульфат, магний хлорид и аспартат магния, Концентрация осаждающего средства может быть точно соотнесена с объемом изучаемой пробы, Для осаждения не НО 1.- липопротеиноа, пробы приводится в контакт с носителем, проницаемым для жидкости, содержащим осаждающее сред- стао. Тем самым начинается процесс осаждения, Менее чем за одну минуту, а благоприятных случаях уже после 10 с, заканчивается образование осадка и жидкость из носителя может быть удалена. Этот процесс осуществляется путем непрерывной или дискретной фильтрации под действием сил тяжести или путем отсоса 5 жидкости,Предпочтителен отсос жидкости посредством капиллярных сил в Следующий носитель, в котором происходит отделение, выпавшего в осадок, липопротеина, кроме "0 НО, Для этого необходимо, чтобы носителимогли контактировать друг с другом, Менее предпочтительно отделение осадка другим способом таким как например центрифугирование, хотя оно также возможно, без 15 отказа от преимуществ. быстрого осаждения. Было установлено, что осадкц липопротеинов, которые образуются при воздействии на биологические пробы комбинации полианионов и указанных двухва лентных кэтионов, задерживаются вплетении из волокон, Предпочтительно неупорядоченное распределение волокон в плетении. В качестве волокон предпочтительны стекловолокно и смеси с вышеуказанными волокнами. Преимущество имеют волокна, которые образуют плетения диаметром от 0,5 до 5,0,им. Вес одного квадратного метра .плетения равен от 20 до 50 гlм, предпочтительно вес от 23 дог30 г/м и влагоемкость от 320 до 420 гам при толщинеот 0,19 до 0,23 мм, Системы, содержащие стекловолокно, их возможное пространственное расположение и размеры волокон описаны в патенте ФРГ Из 3029579. Далее, плетение из волокон может быть упрочнено при добавке соответствующих средств либо неорганической природы (например, жидкое стекло или органической приооды например, поливинилацетат, эфир 40 полиакриловой кислоты или другие подобные вещества), Эти добавки влияют, между прочим, на склеивание волокон к местам, на которых они контактируют друг с другом, и этим путем улучшают механическую устой чивость волоконного сплетения, Жидкаячасть нанесенной пробы беспрепятственно распространяется по всему плетению и может, при подходящем геометрическом распределении, или при преодолении, 50 существующих внутри плетения капиллярных сил, его покинуть. Этим путем можно с помощью простого вспомогательного средства осуществить разделение осаждаемого липопротеина, кроме НО и неосаждаемого 55 НО-липопротеина, Биологическими жидкостями, из которых, в соответствии с предложенным способом, могут быть выделены липопротеины, кроме НО, являются, прежде всего. цельная кровь. сыворотка или плазма,Предложенный способ выделения липопротеинов, кроме НО может особенновыгодно применяться для количественногоопределения НОЕ-холестерина с помощьютестовых полосок. Для этого жидкость, из 5которой, в соответствии с вышеописаннымспособом были выделены липопротеины,кроме НО, приводится в контакт с реагентами, которые требуются или полезны дляпроведения реакции, например, для реакции обнаружения холестерина.Предложенный способ, по сравнению сизвестным способом, имеет большое преимущество, Можно использовать также небольшой объем жидкостей. Обращение с 15предложенным средством очень простое,Требуется Только два основных действия, аименно, подача жидкой пробы и регистрация измеряемой величины холестерина нафотометре после определенного времени, 20Отсутствует этап переливания, Можно просто использовать все:сорта крови, а такжецельную кровь, когда подключен разделительный холст для клеток. Если к исследуемой пробе должны быть добавлены 25антикоагулянты, рекомендуется компенсировать вызываемое этим влияние на процесс измерения. Отделениелипопротеинов, кроме НО, происходит менее чем за 60 сек, Дозирование объемов 30пробы сильно упрощено.П р и м е р 1, Носитель осаждающегосредства для плазмы.Комплексная полиэфирная ткань(1000 Ф ячейки, 105 рм толщина ткани, 50 35нитей на 1-ом сантиметре, с 815 л пропускаемой воды на 1 м и сек.) импрагнируетсяраствором следующего состава, г;Нерез-буфер, 50 рм; рН 7,0 78,00Ацета.г магния х 4 Н 20 15,68 40Сульфат декстрина(Мол.вес 50000) 2 57Альбумин (БСА) 1,78На 1 м носителя наносится около 57 млраствора. После, сушки потоком теплого воздуха, импрегнированная ткань разрезаетсяна отдельные куски для проведения соответствующего теста,П р и м е р 2. Носитель осаждающеговещества для сыворотки. 50Здесь пои выполнении работ следуетиспользовать следующий пропитывающийраствор, аналогичный тому, который приведен в примере 1, г:Нерез-буфер, 50 рм; рН 7,0 78,00 55Ацетат магния х 4 Н 20 10,10Сульфат декстрана17,140,191,31 11,70 020 сыворотки 1,78Н 20 5,58П р и м е р 3. Носитель осаждающеговещества для крови.Бумага соответствующей толщины и поглощающей способности, весом 12 г/см итолщиной 50,им импрегнируется следующим пропитывающим раствором, г;Нерез-буфер, 50 мгр.мол;рН 70 7020Ацетат магния х 4 н 20 4,78Сульфат декстрина(мол, вес 50000) 2,54Альбумин коровьейсыворотки . 1,60Н 20 7,80С помощью этого носителя достигаетсянанесение около 63 мл раствора на 1 мг.П р и м е р 4. Реактивная пленка.Для изготовления реактивной пленкидля количественной оценки НО:холестерина готовится дисперсия следующего состава, г;К/Ка-фосфатный буфер,0,5 МКетрол РТ 02 (порошок)Диоктилнатрийсульфосукцинат 0,40Дисперсия поливинилпропионата (50 оь в Н 20)Диатомовая земля(Келатом, мол. вес. 25) 17,65Фенилсемикарбазид 0,0252/4-гид рокси,5-диметоксифенил/-4-/4-демитиламинофенил/-5-метили мида зол-ди гид рохлорид 0,061Метанол 1,74Н 20 46,28Холестеринзстераза 23700Холестериноксидаза 6500Г 1 ероксидаза 230000Гексанол 2,07Дисперсия толщиной слоя в 300,им наносится на поликарбонатную пленку и сушится с помощью теплого воздуха,Получаемый реактивный слой дает в зависимости от содержания холестерина в холестеринсодержащих жидкостях ступенчатуюгамму голубых цветов (см, таблицу).Концентрация Ремиссия, Вхолестерина (при измерениях с помощьюотражательного фотометраВейога В70,043,01799472 Составитель Л, СабуроваТехред М,Моргентал Корректор Н. Король Редактор Заказ 793 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул,Гагарина, 101 406080100Пример 5,Волоконное плетение,Смесь из боросиликатного стекловолокна диаметром 0,6 рм и целлюлозных волокон с диаметром волокон около 4 рм. преупочтительно в соотношении 9 к 1. Вес 1 м плетения около 25 г/м при толщине плетения около 0,21 мм; влагоемкость плетения составляет около 370 гlм . Ф ормул а и зо брете н и я 1. Способ отделения составной части НД:холестеринсодержащей жидкости путем фракционирования биологической пробы,отличающийся тем,что, с целью ускорения и упрощения способа, фракцио.нирование проводят помещая биологическую жидкость на средство. состоящее из. носителя, проницаемого для жидкости и содержащего вещество, осаждающее липопротеины низкой плотности ( О) ирасположенного под ним другого носителя,5 задерживающего выпавшие составные части биологической пробы, а прошедшая через средство жидкость содержитНО-холестерин,2. Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и й с я10 тем, что первый носитель выполнен из бумаги и синтетических волокон, причем волокнаимеют диаметр плетения 3 - 100 рм, влагоемкость 25 - 100 г/м, толщину 0,030 -0,150 мм, стеклянных волокон, а также15 гидрофильных мембран толщиной 20-250,ими диаметром пор 0,2 - 20,им.3, Способ по п.1,отл и чаю щи йсятем, что второй носитель выполнен из волокон с неупорядоченным плетением с диа 20 метром плетения 0,5 - 5,0,им ивлагоемкостью 250 - 500 г/м .