Способ определения фосфора в биологических объектах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 5 6 01 й 2178 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Ф БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ (57) Использование: эналитичес Сущность: смешивают исследуе цветореагентом, состоящим из с деновой кислоты, малахитового минеральной кислоты с последу метрированием раствора, в кач молибденовой кислоты использ деновокислый натрий, а в кэчес ральной кислоты - серную ки следующем соотношении ком мас.,ь: малахитовый зеленый 0 натрий мопибденовокислый 2,8 - та серная 12,5 - - 17,5, вода дист ная остальное. 3 табл. ные ме од ред дицина ромеофия: - 203. фикаи неощью ое деЛД, и др, Спраения и содержа 82, с.179 - 185. к лабораторазначено для исследований а, медицины,Способ с применением хлористого олова требует для анализа 0,1 мл сыворотки крови, достаточнотрудоемкий идлительный (1 ч на пробу),Способы определения фосмах еще более длительные и тзатраты времени на их выполнеляют 4 - 24 часа.Для определения фосфора в сыворотке крови заслуживают особого внимания микрометоды, позволяющие определять исследуемый элемент в объемах 0,02 - 0,05 мл сыворотки, Наиболее доступным и легковыполнимым является способ с использованием молибдата аммония и малахитового зеленого, позволяющий без предварительфора в коррудоемкие, ниесостав АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Нэпе С. ЯцЬЬагооэ,), Лаборатортуды исследования в клинике,/ Ппроф. В,В,Меньшикова, М,: Ме1187, с,271 - 272.Каракашов А,В.;, Вичев Е.П, Микторы в клинической лаборатории, СМЕдицина и физкультура, 1968, с,198Грибанов Г,А., Базанов Г.А. Модиция ультрамикроопределения общегоорганического фосфора с поммалахитового зеленого, - Лабораторнло, 1976, М. 9, с.527 - 530.Аликаев В.АПетуховавочник по контролю кормпния животных, М,: Колос, 19 Изобретение относитсяны методам анализа и преднлабораторных и клиническихв Области сельского хозяйствветеринарии, зоотехнии,Наибольшее распространение колориметрическими способами определения фосфора являются: способ с использованиемэйконогена хлористого олова, малахитовогозеленого, гидрохинона (амидола) или ванадо-молибдатный способ,Определение фосфора с эйконогеномимет чувствительность 0,2 - 2,0 мкмольфосфора, однако способ трудоемкий (предварительное осаждение белка, центрифугировэние, термостатирование) и длительный,кая химия. мую пробу с оли молибзеленого, ющим фотоестве соли уют молибтве минеслоту, при понентов, 10 - 0,15;3,0; кисло- иллирован 1795357к анализу, так и за счет увеличения количества проб на одну серию определений (до 30 - 50 вместо 5 - 8).Срок годности цветного реактива составляет, по крайней мере, несколько месяцев (реактив хранился 3 месяца без снижения качества),Способ осуществляется следующим образом: 0,5 г малахитового зеленого растворяют в 250 мл дистиллированной воды, одновременно. растворяют 14,5 г молибденовокислого натрия двухводного в 250 мл 257,-ной серной кислоты. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют. Цвет готового реактива желто-коричневый.Построение калибровочной кривой.439.03 мг высушенного до постоянной массы однозамещенного фосфорнокислого калия (КНзРО) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Концентрация фосфора в основном растворе составляет 100 мг/л. Для приготовления рабочего раствора к 10 мл основного раствора прибавляют 990 мл дистиллированной воды, получая концентрацию фосфора 1 мг/л. Берут 0,3;0,6; 0,9 и 1,2 мл рабочего раствора, содержащих соответственно 0,3; 0,6; 0,9; и 1,2 мкг фосфора, доводят дистиллированной водой до 1,5 мл, добавляют 2 мл цветореагента и через 10 - 20 мин колориметрируют при 600 - 650 нм, Строят график, где по оси абсцисс отмечают концентрацию фосфора в мкг, по оси ординат - зкстинцию калибровочных проб,Ход определения: 0,01 мл сыворотки крови вносят в 1,5 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл цветореагента и через 10 - 20 мин колориметрируют при 600 - 650 нм против холостого опыта без сыворотки крови, Толщина рабочей части кюветы - 5 мм.Для определения фосфора в органах или тканях к навеске ткани (1 г) приливают 10 мл концентрированной серной кислоты и минерализуют до обесцвечивания, объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл, Для определения фосфора берут 0,025 - 0,050 мл раствора и дальнейшие операции проводят так же, как и при опре 0,10 - 0,15 50 делении фосфора в сыворотке крови, В табл,1 показано определение оптимального соотношения компонентов,Из табл,1 следует, что наиболее оптимальными соотношениями компонентов являются; малахитовый зеленый - 0,10 - 0,15 молибденовокислый натрий 2,8 - 3,0; кислота серная 12,5 - 17,5;,При сравнении устойчивости цветного реактива, приготовленного на растворах с ного осаждения белков определять фосфорв 0,02 мл сыворотки крови. Этот способ является наиболее близким по техническойсущности и принят зэ прототип. Сущностьспособа заключается в том, что в присутствии 5неорганического фосфора молибденовая кислота образует фосфорномолибденовую гетерополикислоту, которая, реагируя сосновным красителем малахитовым зеленым,дает зеленовато-синее окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству фосфора. Белок не мешает проведениюданной реакции, поэтому депротеинизациюне проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса враствор добавляют твин.Недостатки способа, принятого за прототип, следующие: неустойчивость окраскихолостой и опытной пробы во времени,вследствие чего снижается точность определения; необходимость приготовления нового цветного реактива каждые 2-3 недели,что достаточно трудоемко,Целью предлагаемого изобретения является сокращение длительности способа,повышение точности и чувствительностиего.Поставленная цель достигается тем; чтов известном способе определения фосфорав биологических объектах путем обработки 30анализируемой пробы цветореагентом, содержащим соль молибденовой кислоты, ма- .лахитовый зеленый и минеральную кислотус последующим фотометрировэнием раствора, согласно изобретению, в качестве соли молибденовой кислоты используютмолибденовокислый натрий, а в качествеминеральной кислоты - серную кислоту приследующем соотношении компонентов,мас,%: 40МалахитовыйзеленыйМолибденовокислый натрий 2,8 - 3,0Кислота серная 12,5 - 17,5 45Вода дистиллированная ОстальноеНаиболее существенным преимуществом заявляемого способа является повышение точности определения содержанияобщего или неорганического фосфора засчет стабилизации окраски полученной фосфорно-молибденовой гетерополикислотыво времени и чувствительности за счет использования молибденовокислого натрия. 55Кроме того, при использовании данногоспособа производительность труда лаборанта при определении фосфора повышается в 1,2 - 1,5 раза как за счет уменьшенияколичества операций при подготовке пробы серной и соляной кислотами, установлено1795357 табл.2), что в то время как реактив с соляной кислотой постоянно менял свою окраску во времени в присутствии твинаили без него, реактив с серной кислотой был полностью устойчив в течение всего исследуемого Промежутка времени. Использование твинав цветном реактиве с соляной кислотой замедляло интенсивность развития окраски, но не устраняло ее, В цветном реактиве с серной кислотой нет необходимости применить твинв качестве стабилизатора. В табл.2 показано сравнение устойчивости цветного реактива с различными кислотами,При сравнении точности обнаружения фосфора с помощью цветного реактива с различными кислотами установлено, что при использовании цветореагента с соляной кислотой ошибка в точности определения на 11-й и 30-й мин составила 34 , в то время как при использовании серной кислоты данные в указанном временном интервале совпали.Замена молибденовокислого аммония на молибденовокислый натрий привела к 30 Способ определения фосфора в биологических объектах путем обработки анализируемой пробы цветореагентом, содержащим соль молибденовой кислоты, малахитовый зеленый, минеральную кислоту и воду с последующим фотометрированием раствора, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения длительности способа, повышения точности и чувствительности 2,8 - 3,012,5 - 17,5 Таблица 1 Соде жание компонентов в смеси, мас 0 Компонент 0,150 3,0 12,5 100 0,15 2,80 12,5 100015 3,0 15,0100 0,300 3,0 12,5 100 0,15 3,00 12,5 100 0,15 3.0 20,0 100 0,100 3,0 12,5 100 0,15 2,70 12,5 96,4 0,15 3,0 12,5 100 0,050 3,0 12,5 95,5 0,15 2,60 12,5 92,0 0,15 3,0 10,0 97,7 0,025 3,0 12,5 62,4 0,15 2,50 12,5 82,3 0,15 3,0 7,5 61,1 Формула изобретения Малахитовый зеленыйМолибденовокислый натрийКислота сернаяОпределение фосфора,Малахитовый зеленыйМолибденовокислый натрийКислота сернаяОпределение фосфора, %Малахитовый зеленыйМолибденовокислый натрийКислота сернаяОп еделение ос о а,повышению чувствительности способа в 2,0 - 2,5 раза без снижения точности определения фосфора,Для сравнительного изучения предло женного способа с прототипом было определено количество общего фосфора в 5 опытных образцах сыворотки крови кур в тканях яйцевода и яичника индеек-несушек.10 Как видно из табл,3, совпадение результатов при использовании предлагаемогоспособа через 10 и 20 мин измерения составляет практически 1000 , в то время, как15 в прототипе через 20 мин зта величина составляла 80 - 83% от количества фосфора,измеренного через 10 мин. Совпадение результатов при использовании обеих способов через 10 мин после приготовления20 растворов во всех случаях удовлетворительное (4,5% для сыворотки крови кур и 0,45 -3,91 для тканей яйцевода),Способ прост в использовании, хорошовоспроизводим и не требует сложного обо 25 рудования и дефицитных реактивов,его, в качестве соли используют молибденовокислый натрий, в качестве минеральной кислоты - серную кислоту при следующем соотношении компонентов мас. ;35 Малахитовыйзеленый 0,10 - 0,15 Молибденовокислый натрийСерная кислота40 Дистиллированная вода Остальное 0,2003,0 12,5 100 0,15 2,90 12,5100 0,15 3,017,5 1001795357 Таблица 2 блица 3 Редакто орректор С,Патруше Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина. 101 Заказ 426ВНИИП оставитель Е,Белецкийехред М,Моргентал Тираж Подписноеосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб 4/5