Штамм бактерии brucella авоrтus, используемый для изготовления вакцин против бруцеллеза

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВЗНОСЕА АВОЯТОЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА(57) Использование: микробиология, профилактика бруцеллеза, вакцина против бруцеллеза. Сущность изобретения; вакцину готовят из нового штамма ВгисеИа аЬойиз ВГНКИ М 20-1-ДЕП, Штамм отличается низкой остаточной вирулентностью отсутствием абортогенности и агглютиногенности, Для получения вакцины штамм выращивают, отделяют клетки, доводят их концентрацию до 10 млрд,кл/мл и расфасовывают, Вакцина по иммуногенным свойствам превосходит вакцинный штамм 19 и не вызывает образования агглютининов, что позволяет постинфекционные реакции от поствакцинальных, 1 табл. Недостатком п вакцинный штамм глютиноген ными привитых животнь ции, которые труд тивности у зар вызывает аборты у Цель изобрете бруцелл для созд щей высокой стабГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Северо-Кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт и Донской сельскохозяйственный институт (72) В,С.Рягузов, В,Н.Никитенко, А.П,Пономарев, Г.Е.Ирская, П,М,Потатуркин, Л.В.Ропаева, И,П.Хабузов, Л.А,Малышева, А.А.Харченко и С,Г.Щипко(56) 1, Ромахов В,АКлочков А,А. и др. Иммуногенные свойства вакцины из штамма Вг,аЬогтцз 104-М в опыте на морских свинках. Труды ВИЭВ, 1985, т. 63, с. 7 - 11.2,Михайлов Н,А, Салманов К,М. и др. Результаты проверки свойств отдельных серий сухой живой противобруцеллезной вакцины из штамма 82, Научные труды Казанского ветеринарного института, 1980, т, 135, с. 48-60.З.Вершилова П.А., Чернышева М,И. Испытание иммунитета у морских свинок, вакцинированных Вг.аЬопаз 19 В А к высоковирулентной культуре Вг.заз 1330, - Ветеринария, 1959, М 12, с. 23.4;Шевченко Н., Малахова Т. и др. Сравнительное испытание иммуногенных и анти- генных свойств противобруцеллезных вакцин из различных штаммов, Труды Уз, НИВИ, 1978, т. 28, ч, 1, с. 142 - 147,4.Изобретение относится к микробиологии и предназначено для получения противобруцеллезной вакцины, Известны вакцинные штаммы бруцелл: 104 М, 82, 19 ВА, Штаммы 104 М и 19 ВА обладают высокой иммуногенностью и агглютиногенностью. Штамм 82 иммуногенный, слабоагглютиногенный. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм В гцсеПа аЬогтцз. рототипа является то, что 19 обладает высокими агсвойствами, вызывает у х серопозитивные реакно отличить от серопозиаженных животных и стельных коров,ния - получение штамма ания вакцины, обладаюильностью, иммуногенно1761796 ют в пробирки с мясопептонным глюкозно 55 стью, безвредностью, и слабой агглютиногенностью, неабортогенностью,Сущность изобретения. Новый штаммВг,аЬопцв 21 - 5 получен из штаммаВг.аЬогмз 21 путем пассажирования черезорганизм стельных коров и отселекционирован в стабильных Р - формах.Штамм Вг,аЬогсцз 21-5 депонирован влаборатории контроля и стандартизациибруцеллезных и кампилобактериозных препаратов ВГНКИ,.Штамм Вг,аЬогсцз ВГНКИ М. 20-1-ДЕПхарактеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биологическими признаками.Морфологические: клетки штамма 21 - 5представляют коккабактерии 1 - 1,5 мкм вдлину, по Граму отрицательны, по Козлов.скому сохраняют красный цвет, по Романовскому - нежно-фиолетовый.Культуральные: бактерии штамма 21 - 5хорошо растут на глюкозно-глицериновомпеченочно-пептонном бульоне и агаре Д идругих средах, имеющих нейтральную илислегка щелочную реакцию (рН 6,8 - 7,2) ваэробных условиях при температуре 37 С.На плотной среде образуют выпуклые, матовые, полупрозрачные колонии.Биохимические: штамм 21 - 5 представлен Р - (100%) колониями, при окраске поУайт-Вилсону реакция с трипафлавином положительна, с Р - сывороткой агглютинируют; сероводород не образует, каталазнаяактивность незначительная, не ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, рамнозу, инозит, Растет на среде с содержаниемфуксина, а при аналогичном содержании тионина рост не отмечается,Серологические признаки, не вызываетагглютининов и комплементсвязывающихвеществ в диагностических титрах, Агглютинируется К-сывороткой,Биологические признаки; непатогенен,неабортогенен (безвреден), и риживаемостьна морских свинках при дозе 100 м,к. до 2-хмес., 2 млрд.м.к, - до 3 мес, пассажированчерез организм пяти стельных коров и десчтикратно через организм морских свинок,Миграцией на привитых животных не обладает. Иммуногенные признаки: иммуногенность в эксперименте на морских свинках составила 63,6 - 83,3 , на крупном рогатомскоте 75 о ,Отличительные признаки штамма Бруцелла абортус 21-5:а) слабая агглютиногенность, При прививках лабораторных животных и крупного рогатого скота не вызывает образования аг 10 15 20 25 30 35 40 45 50 глютиннов и комплементсвязывающих веществ в диагностических титрах;б) высокая иммуногенность у морских свинок до 83,3 очерез 3 месяца, а на крупном рогатом скоте до 75% спустя год после прививок;в) непатогенен: безвреден (неабортогенен). Приживаемость у морских свинок при дозе 100 м,к, до 2 мес 2 млрд м,к, до 3 мес; г) от вакцинированных животных на невакцинированных не мигрирует,. Отличие штамма Вг,аЬогсцз 21 - 5 от близких штаммовШтамм Вг.аЬопцз 21 - 5 отличается от слабогглютиногенного штамма Вг.аЬойцз 82 меньшей остаточной вирулентностью (отсутствием абортогенности), отсутствием сохранения агглютининов и комплементсвязывающих веществ,Отличается от агглютиногенного штамма ч. 19 отсутствием агглютиногенности, что позволяет отличать постинфекционные реакции от поствакцинальных., Пределы варьирования признаков (5 - 10)Селекционирован в Р-форме из пятикратно пассажированной через организм стельных коров культуры.,Рост на глюкозноглицериновом МПА наблюдается в виде 100 колоний, содержащих Р-формы бруцелл по антигенным свойствам,П р и м е р 1, Вакцинный штамм Бруцелла абортус 21 - 5 получен следующим образом, Методом неоднократных воздействий ультрафиолетовыми лучами из вирулентной культуры вначале получен штамм 21, Затем проведен пассаж культуры штамм 21 через организм 5 стельных коров (сроки от 3 до 8,5 мес), Дозы вакцины от 100 млрд(1-я корова), 2 - 3 коровы по 200 млрд, 4-я - 220 млрд, 5-я - 300 млрд. Спустя один месяц от вакцинированных неделей, выделяли культуры штамма Вг.аЬогцз, которых изолировали из региональных лимфатических узлов, предлр 1 аточных и надвыменных. Из 5-го пассажного варианта селекционирован вакцинный штамм 21 - 5 в Р-форме.П р и м е р 2, Методика изготовления и контроля вакцины из штамма Бруцелла аЬопцз 21 - 5, Культуру штамма 21 - 5 засеваглицериновым агаром, имевшим рН 6,8 - 7,0. После двухсуточного культивирования в термостате при 37 С в каждую пробирку вносят по 2 мл физраствора и смазывают бактериальную массу, Делают посевы на матровые колбы со скошенным мясо-пептонным глюкозоглицериновым агаром (МПГТА). Поверхность агаровой пластинки тщательно увлажняют засеянной суспен 1761796зизй и матровые колбы помещают в термостат, После двухсуточного выдерживания при 37 С колбы вынимают и проводят визуальный осмотр с целью выявления загрязнения посевов. Затем в каждую колбу вносят по 40 - 50 мл физраствора и тщательно смывают бактериальную массу. Из смыва каждой колбы готовят мазки, окрашивают их по методу Грэма, Козловского и микро- скопируют для проверки чистоты смывов, Колбы, в которых обнаруживают постороннюю микрофлору, выбраковывают, а из остальных полученную взвесь сливают в мерный цилиндр для определения общего объема смыва.При установлении концентрации бруцелл вакционного штамма 21 - 5 в полученной взвеси используют оптические стандаоты мутности.Доводят концентрацию бруцеллезных клеток до 10 млрд в 1 мл. После этого вакцину расфасовывают в стерильные флаконы по 250 мл, заливают пробки сургучом и хранят в холодильнике при 5 С до употребления.Помимо оптической устанавливают и биологическую концентрацию вакцины,Определение проводят путем приготовления последовательных разведений исходной взвеси с оптической концентрацией 10 млрд.м.к, в 1 мл в пробирках с 4,5 мл физраствора до получения конечного разведения .1:100 с последующим посевом 0,1 мл каждого из двух последних разведений (1:100 и 1;1000) на 3 - 4 чашки Петри с глюкозно-глицериновым агаром из рыбного гидролизата, Посевы выдерживают в термостате при 37 С в течение 4 - 6 дней, после чего проводят подсчет выросших колоний, Определяют среднее арифметическое число живых бруцелл, содержащихся в 1 мл каждого разведения, Полученные цифры складывают и делят на 2 (количество разведений). Данное число отражает сред 5 10 15 20 25 30 35 40 нее количество живых клеток, содержащихся в 1 мл приготовленной вакцины,До употребления вакцину проверяют также на чистоту роста и безвредность, Чистоту культуры проверяли микроскопическим исследованием мазков, приготовленных из полученной вакцины и окрашенных по методам Грэма и Козловского. Кроме того, еще йроводится высев на пластины МПГТА в чашки Петри для исключения загрязнения вакцины аэробными микроорганизмами, Из подозреваемых колоний готовят мазки, окрашивают и микроскопируют.Загрязненность анаэробными микроорганизмами исключается высевом вакцины на среду Китт-Тароцци,Безвредность проверяют подкожным введением вакцины двум беременным морским свинкам в дозе 1 млрд м.к. с последующим наблюдением за ними и исследованием от них сывороток крови через 2 недели в РА и РСК, Абортов и положительных результатов серологических реакций, как правило, не отмечалось, Данные приведены в таблице,Тестами для определения диссоциации служит трипафлавиновая проба, реакция термопреципитации и окраска колоний, выросших на пластине агара в чашках Петри по Уайту и Вилсону.Трипафлавиновая проба и реакция термопреципитации всегда были положительн ыми.Окраской колоний кристаллвиолетом по Уайту и Вилсону обнаруживали до 100шероховатых К-форм колоний. Как видно из таблицы, штамм Бруцелла абортус 21 - 5 по иммуногенным свойствам превосходит коммерческий штамм Бруцелла абортус 19.Формула изобретения Штамм бактерий Вгцсе 1 а аЬогтцз ВГНКИ М 20-1-ДЕП, используемый для изготовления вакцин против бруцеллеза,71 1761796 8УСравнительные данные по иммуногенности противобруцеллезных вакцинСоставитель Л,МалышеваРедактор М.Самерханов Техред М.Моргентал, Корректор М,ПетроваЗаказ 3235 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская,наб 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101