Способ микроклонального размножения ели обыкновенной ин витро

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 176 9 А 01 Н 4/00, С 12 К 5/О ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ К сится к методам микожения растений ин пользовано для ускосадочного материала ых пород,Изобретение отн роклонального разм витро и может быть и ренного получения и северных видов хвой ения пророст- онов ели, вклюенного каллуса ышей на полоде Брауна и Лофтилуксусной иуксусной кисопурина (БАП), эмбрионов на ьд и Эриксона изовой кислоты а той же среде Айlапп Я.В. -ода к генез,матиит обет два основных подх ванию ин витра: органа образуются побеги, и с огенез, когда происход брионов не из зиготы, к ножении, а из сомати Существумикроклонирпри которомческий амбриразование эмполовом размклеток. кпрески ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Ленинградский научно-исследовательский институт лесного хозяйства(56) ЧегЛадеп Я,А., ччапп ЯЯ, - Могаау зргцсе зотат 1 с етЬгуодепезз: ЬдЬ ангесцепсу 1 птат 1 оп гогот 119 Ьт-сц 1 тцгеб тамге етЬгуоз. - Р 1 апт СеП. Т ззце а, Огдап Сц 1 цге 1989, 16, с. 103 - 111..а 1 п Я.М., йеччтоп Й,1, Яотез Е.1. - ЕпЬйлсетепт о 1 зотат 1 с етЬгуодепезз 1 и йооаау зргцсе (Р 1 сеа аЬез 1,) - ТЬеогет са 1 а, арр 11 еб депетсз 1988, 76, 4, с, 501-506.Весааг М.Я., Мо 1 апб ТЛ.,И/усКОИ 1,1, - Матцгатоп, дегтпатот апс Сопчегзюп о 1 Могччау зргцсе (Р 1 сеа аЬез 1.) зотатс егпЬгуез со ралмаз - 1 и ч 1 тго, 1989, ч. 25. М б, с. 575-580.Агпоб ЯНаКтап 1. - Яедц 1 атот о 1 зотабс егпЬгуо оече 1 ортепт 1 и Рсеа аЬ 1 ез Ьу аЬзс 1 з 1 з асЫ (АВА) - 1, Р 1 апт роузо 1, 1988, 132, 3, с. 164-169,(54) СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЕЛИ ОБЫКНОВЕННОЙ ИН ВИТРО(57) Использование: биотехнология, культивирование тканей и клеток, лесное хозяйство, Сущность изобретения: зиготический зародыш эксплантируют на питательную среду Арнольд-Эриксона, получают первичный каплус, который переносят на ту же среду, дополнительно содержащую б- БАП и АБК, получают соматические эмбриоиды, Полученные эмбриоиды помещают на жидкую питательную среду, содержащую 2 сахарозы и 1/4 часть ингредиентов по прописи Арнольд-Эриксона и получают регенеранты с использованием для поддержки гранул полиэтилена высокой плотности, 1 з. и, ф-лы, 2 табл. М Известен способ получ ков из соматических эмбри чающий получение эмбриог из зрелых семенных зарод винной агаризованной сре ренса с добавлением на (НУК) или 2,4-дихлорфенокс лоты (2,4-Д) и б-бензиламин созревание соматических агаризованной среде Арно с добавлением 0,3 мг/л абсц (АБК) и индукцию корней н без гормонов, (Чейадеп 8.50 55 йолмау зргисе зогпабс егпЬгуодепев 1 з: ЫдЬ 1 гедиепсу 1 п 1 сат 1 оп 1 гоп дат-ситигеб гпасиге егпЬгуоз, - Р 1 апт СеИ, Т 1 ззие а. Огдап Си 1 тиге. 1989, 16, с. 101 - 111).Известен способ, при котором культивирование зрелых зародышей происходит в темноте с использованием на первом этапе среды Арнольд и Эриксона с добавлением 2,2 мг/л 2,4-Д, 1,1 мг/л БАП и 1 О сахарозы, а на втором этапе с добавлением 0,2 мг/л НУК и 0,3 мг/л АБК, (Та 1 п Я.М. Меасоп Я,., Яотез Е,1. - ЕпЬапсевепт о 1 зогпас 1 с егпЬгуодепезз 1 п Когччау зргисе (Р 1 сеа аЬ 1 ез 1) - ТЬеогет 1 са 1 а, арр 1 еб. депеОсз, 1988, 76, 4, с. 501-506),Известен способ поэтапного культивирования незрелых зародышей на агаризованной среде Арнольд и Эриксона с 2,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л БАП (для инициации эмбриогенного каллуса), с 1% активированного угля в течение 1 недели, с добавлением 0,3 мг/л АБК и 0,2 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК) в течение 2 недель и с дальнейшими пересадками на свежую среду с АБК и ИМ К через каждые 3 недели (для стимуляции созревания), с разбавлением среды 1:3 и исключением гормонов (для проращивания соматических эмбрионов). (Весччаг М,К., Моапб Т,1 И/усатой 1.1. - Матигабоп, деггп 1 пабоп апб сопчегз 1 оп о 1 Иопчау зргисе (Рсеа аЬез.) зогпа 1 с егпЬгуоз со р 1 апсз, - 1 п что, 1989,25, 6, с. 575 - 580).В СССР вообще нет публикаций, касающихся соматического эмбриогенеза хвойных пород ин витро,Общим недостатком описанных спосов является невысокая продуктивность отдельных этапов формирования соматических эмбрионов и низкий выход регенерантов,Наиболее близким к предлагаемому является способ регенерации растений из зрелых и незрелых семян путем темновой индукции эмбриогенного каллуса на среде Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:1, с 1,9 мг/л НУК, 1,1 мг/л БАП и 1 О/ сахарозой, темновой стимуляции созревания соматических эмбрионов на той же среде с 2,0 мг/л АБК и Зо/о сахарозы и укоренения на свету при 20-часовом фотопериоде на безгормонной среде Арнольд и Эриксона с.2 оь сахарозой (Агпо 1 б Я., НаКгпап 1, - Яеди 1 абоп о 1 зогпатз егпЬгуо бечеоргпепт 1 п Рсеа аЬез Ьу аЬзсвз асб (АВА) - Л. Р 1 аги РЬузо 1 1988, 132, 3, 164-169).Однако выход растений-реагентов по данному способу также невелик;Целью изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов,5 10 15 20 25 30 35 Поставленная цель достигается тем, что в отличие от известного способа, включающего инициирование эмбриогенного каллуса на агаровой питательной среде Арнольд и Эриксона, получение соматических эмбрионов на той же питательной среде с использованием абсцизовой кислоты и последующее их проращивание, на этапе получения соматических амбрионов на питательную среду Арнольд и Эриксона абсцизовую кислоту вводят совместно с 6-бензиламинопурином, а проращивание осуществляют на свету на жидкой среде Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3 с 2 О сахарозой. В качестве поддержки при проращивании используют гранулы полиэтилена высокой плотности,Абсцизовую кислоту и 6-бензиламинопурин вводят в питательную среду в количестве 2 мг/л и 0,2 мг/л соответственно,Таким образом, сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом подтверждает его соответствие критерию изобретения "новизна".Для выявления соответствия заявляемого технического решения критерию "существенные отличия" проведен поиск известных решений, содержащих отличительные от прототипа признаки, в результате которого выявлено раздельное поэтапное введение БАП и АБК в питательную среду, в частности, во всех указанных выше аналогах, где они выполняют свою роль регулятора роста,Действие АБК известно как ингибитора клеточных делений, ростовых и регенерационных процессов, как индуктора старения,ингибитора синтеза РНК, ферментов белкового синтеза и фотосинтеза. (В,И, Кефели, В.М, Коф, П,В, Власов, Е.Н, Кислин. Природный ингибитор роста - абсцизовая кислота, М. Наука, 1989, с, 183).Отмечена роль БАП в активизации клеточных делений, ростовых и регенерационных процессах, в задержке старения, его способность активизировать синтез РНК и белка, ферментов белкового синтеза и фотосинтеза, активизировать транспорт метаболитов(О,Н. Кулаева. Цитокинины, их структура и функция. МНаука, 1973, с, 264. Е.Г. Романенко, С,Ю. Селиванкина и др, Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза РНК ин витра, Докл. АН СССР 1980, 252, 2, 488 - 489),Известно стимулирующее действие АБК и БАП (вместе) на синтез РНК, причем АБК увеличивает количество РНК с низкой молекулярной массой, а БАП - с высокой(С,Ю. Селиванкина, Романенко Е.ГКаравайко М.Н Кулаева О.Н, Активизация синтеза РНК ин витро под действием цитокинина и абсцизовой кислоты в присутствии цитокининосвязывающих белков, Докл, АН СССР, 1983, т. 272, 3, 761 - 763).Однако совместное применение АБК и БАП в данном случае использовалось лишь для изучения механизма их действия и не затрагивало проблемы морфогенеза.Эффект применения АБК на стадии формирования зрелых соматических эмбрионов связан с торможением деления эмбриогенных клеток, в результате чего, по-видимому, создаются благоприятные эндогенные условия для дальнейшего развития образовавшихся ранее проэмбриональных структур,Усиление действия АБК в присутствии БАП скорее всего объясняется способностью последнего активизировать транспорт подвижных метаболитов к центрам эмбриональной активности, Таким образом, при совместном введении в питательную среду БАП и АБК проявляется новое их свойство как стимулятора созревания соматических эмбрионов, что ведет в свою очередь к увеличению выхода растений-регенерантов,Таким признаки, как проращивание соматических эмбрионов на свету на жидкой среде Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3 с 2 сахарозой, с использованием в качестве подддержки гранул полиэтилена высокой плотности не выявлены в других технических решениях при изучении информационных источников в данной области биологии. Следовательно, заявляемый объект соответствует критерию изобретения "существенные отличия",Предлагаемый способ реализован следующим образом, Опыты были проведены в лаборатории лесовосстановления ЛенНИИЛХ.При инициировании эмбриогенного каллуса зрелые и незрелые семенные зародыши ели помещают на агаризованную модифицированную среду Арнольд и Эриксона (1981) с 450 мг/л МН 4 ИОз, 50 мг/л 1:глутамина, 3 сахарозы, 2,2 мг/л 2,4-Д(дихлорфеноксиуксусной кислоты) и 1,1 мг/л бензиламинопурина.Полученный на этой среде эмбриогенный каллус через 6 недель переносят на поддерживающую рост среду Арнольд и Эриксона, разбавленную 1:1, с 1200 мг/л ЙНдйОз,50 мг/л 1:глутамина, Зсахарозы, 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л БАП, продолжительность культивирования на которой еще 6 недель. Первые 9 недель культуры растут 25 30 35 д 0 45 50 55 в темноте, затем при 16-часовом фотопериоде до формирования соматических эмбрионов,Для стимуляции созревания соматических эмбрионов каллус переносят на среду того же состава с пониженным до 2 содержанием сахарозы, 0,2 мг/л БАП и 2 мг/л АБК, Затем через каждые 3 недели каллусы пассируют на эту же основную среду с 2,0 мг/л АБК без БАП и многократно отделяют созревшие соматические эмбрионы.На этапе проращивания отделяемые соматические эмбрионы высаживают на стерильные гранулы полиэтилена высокой плотности, покрытые слоем марли, увлажненной жидкой безгормональной средой Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3, с 2 сахарозой,После 4 недель проращивания проростки с первичным корнем длиной не менее 10 мм высаживают в стерильную смесь торф- песок-перлит(6:2:1 по объему). Растения содержат под полиэтиленовой пленкой при 16-часовом фотопериоде (освещенность 3,0 тыс. лк), ежедневно опрыскивают водой и через день поливают раствором минеральных солей по Арнольд и Эриксону, разбавен 1;3,В тех же условиях были проведены опыты, в которых на этапе проращивания соматических эмбрионов использована агаровая среда по прототипу и жидкая среда Арнольд и Эриксона, разбавленная 1;3, с различным содержанием сахарозы,Опытные данные сведены в таблицу, Наилучшие результаты отмечены при использовании жидкой среды Арнольд и Эриксона, разбавленной 1;3, с 2 сахарозой.При использовании 1 сахарозы получают лишь 55 корнеобразования,Увеличение же содержания сахарозы выше 2 не влияет на процент корнеобразования, не уменьшает длину корня, что важно при перенесении проростков е почву,Из приведенных результатов исследований видно, что при использовании жидкой среды Арнольд и Эриксона, разбавленной 1:3, образование корней увеличивается до 82по сравнению с 32 на агаровой среде по прототипу,Таким образом, предлагаемый способ за счет стимуляции созревания соматических эмбрионов и стимуляции корнеобразования, достигаемой совокупностью отличительных признаков, дает сле1761057 Формула изобретения Таблица 1 блица П е лагаемый способ вестный способ а акте истик Частота образовотносительно ввешей о Среднее количеснов, отделяемыхЧастота ко необ ния эмбриогенных линииденных в культуру зароды 5 о соматических эмбрио1 г каллусазования 51 32 оставитель Г, Ширяевехред М.Моргентал Корре Редактор М. Васильева ереши аказ 3199 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 венно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 ои дующие преимущества на примере незрелых семян(табл.2),При использовании в опытах зрелых семян изменяется лишь показатель частоты образований эмбриогенных линий, составляющий 65 о .Предлагаемый способ позволяет получить в среднем 200 проростков от одного зрелого семени и 300 от незрелого на срок 6 - 7 месяцев,1. Способ микроклонального размножения ели обыкновенной ин витро, включающий эксплантацию зиготического зародыша и инициацию эмбриогенного каллуса на агаризованной питательной среде Арнольд и Эриксона, содержащей ауксины и цитокинины, получение соматических эмбрионов на той же питательной среде, содержащей 2,0 мг/л абсцизовой кислоты, и последующее выращивание из эмбриоидов растений-регенераторов на безгормональной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода растений-регене рантов, на этапе получения соматическихэмбриоидов в питательную среду абсцизовую кислоту вводят совместно с 6-бензиламинопурином и растения-регенеранты получают на жидкой питательной среде с 10 использованием для поддержки эмбриоидов гранул полиэтилена высокой плотности, при этом содержание сахарозы в среде составляет 2%, а остальные ингредиенты питательной среды разбавляют в соотноше нии 1:3. 2, Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выхода соматических эмбриоидов, для начала стимуля ции их образования 6-бензиламинопуринвводят в питательную среду в количестве0,2 мг/л.