Способ определения биогенных порфиринов

)5 0 01 М 21/64 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт биохимии им. А. Н. Баха иСовместный советско-вьетнамский научноисследовательский тропический центр приИнституте эволюционной морфологии и экологии животных им. А.Н. Северцова(56) Патент СШАМ 4810655, кл. 6 01 М 21/76, 1986,0 адпозз апб йегару о 1 рогрпуг 3 аз апбеаб плохсатоп / Еб. М, Оозз, Зргпдег -Чегад, 1978, р. 203-207,Изобретение относится к способам определения порфиринов и может быть использовано в медицине, биотехнологии, биохимических исследованиях,Определение уровней порфиринов в биологических образцах (моча, сыворотка крови и т,п.) важно при диагностике некоторых нарушений обмена веществ (порфиринурии, порфирии), ряда патологических заболеваний животных и человека, химических интоксикаций, а также в ряде биотехнологических производств (микробтиологический синтез биогенных порфиринов и некоторых витаминов с родственной структурой).Известны способы определения порфиринов с использованием спектрофотометрии, спектроскопии магнитного кругового дихроизма, дифференциальной спектрофотометрии.Недостатками этих способов являются невысокая чувствительность, ограниченная чувствительностью фотометрической детекции порфиринов(около 1 мкг/мл), влиянием оптических свойств исследуемого образца на результаты определения, и невысокая се(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕННЫХ ПОРФИРИНОВ(57) Сущность способа заключается в том, что содержащиеся в образце порфирины предварительно переводят в форму их палладиевых комплексов и затем количественную оценку уровней порфиринов проводят по высокотемпературной фосфоресценции их палладиевых комплексов в водных растворах. 1 з,п. ф-лы, 1 табл,лективность определения порфиринов (влияние примесей пигментов), Это приводит к необходимости дополнительных стадий (разбавление образца, экстракция, концентрирование, фракционное разделение и т.п,), что усложняет анализ, делает его многостадийным и требует большого расхода исходного материала, затрудняет автоматизацию. 4 ъНаиболее близок к предлагаемому спо- а соб определения уровней порфиринов пу- С) тем прямого флуориметрического определения порфиринов в тканях или тканевых жидкостях.Однако нуестентеаьность.метода ограничена высокими фоновыми сигналами, обусловленными светорассеянием тканей ианей тканевых жидкостей (благодаря высокому содержанию белков и других макромолекул), а также собственной флуоресценцией биологических жидкостей. Примеси флуоресцирующих пигментов мешают определению порфиринов, Обычно чувствительность дан10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ного метода не превышает 1 нг/мл порфиринов,Цель изобретения - повышение чувствительности, точности анализа, его упрощение и повышение специфичностиопределения порфиринов.Поставленная цель достигается тем, чтоанализируемые водные растворы биогенных порфиринов обрабатывают в определенных условиях водными растворами ирастворимой соли двухвалентного палладиятаким образом, чтобы количественно перевести содержащиеся в них порфирины в ихпалладиевые комплексы, после чего содержание порфиринов определяют по высокотемпературной фосфоресценциипалладиевых комплексов порфиринов. Измерение фосфоресценции Рб-порфириновпроводят в обескислороженных водныхрастворах при комнатной температуре.Рб-порфирины обладают уникальнойспособностью интенсивно фосфоресцировать в водных растворах при комнатнойтемпературе и могут быть селективно определены в сложных биологических системахс высокой чувствительностью методом импульсной флуориметрии с миллисекунднымвременным разрешением. Режим регистрации люминесценции с временным разрешением практически полностью исключаетвлияние оптических свойств образца и люминесцирующих примесей на результатыопределения Рб-порфиринов,Получаемые при химической обработкепалладиевые комплексы порфиринов являются индивидуальными соединениями (константа диссоциации Рб(11) изпорфиринового макроцикла очень высокая( 10-34 М), которые обладают высокой химической стабильностью, Следовательно,процесс включения палладия в порфириныявляется практически необратимым и неподвержен влиянию последующих стадийманипуляции с образцом.Спектральные свойства палладиевыхкомплексов различных биогенных порфиринов (ди-, тетра-, октакарбоксил ьн ых) практически идентичны. Следовательно, приопределении различных порфиринов или ихсмесей условия регистрации идентичны,Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Получение палладиевыхкомплексов порфиринов,К 1 мл раствора копропорфирина 1 (концентрация 10 нМоль/л) в 0,05 М ацетатномбуфере, рН 5,0, добавляли 0,01 мл растворахлорида палладия (1 1) (0,01 М) в 0,01 М НС иинкубировали на водяной бане при 80 С 3мин. После охлаждения раствора реакцию останавливали добавлением 0,1 мл водного раствора сульфита натрия (100 мг/мл), при этом рН системе устанавливался в районе 7,0. Записывали спектры люминесценции растворов на спектрофлуориметре Л(Регйп Евег) в диапазоне длин волн 550750 нм при возбуждении на длине волны 395 нм. Исчезновение полос флуоресценции порфиринов (в области 620 нм) и появление полос фосфоресценции Рб-порфиринов (в области 670 нм) в спектрах люминесценции свидетельствует о том, что порфирин пол но- стью переходит в форму палладиевого комплекса.Предпочтительные условия получения палладиевых комплексов: 2-15-минутная инкубация в ацетатном буфере, рН 3,0-5,0, при 60-80 С в присутствии 20-500 мкМ Рб (2+),Спектральные свойства копропорфирина и его Рб-комплекса приведены в таблице.П р и м е р 2. Измерение высокотемпературнОй фосфоресценции Рб-порфиринов.Копропорфирин 1 переводили в форму Рб-комплексов согласно примеру 1, используя различные исходные концентрации копропорфирина (0,1.-100 нм), и измеряли интенсивности фосфоресценции растворов в режиме с субмиллисекундным временнымстроби рова нием,Оптимальные условия измерения следующие; возбуждение при 395 нм (спектральная полуширина фильтра около 50 нм), регистрация при 665 нм (полуширина около 50 нм), Частота вспышек лампы 1 кГц (полуширина вспышки - не более 10 мкс), время задержки после вспышки 100 мкс; воротасчета 800 мкс; время накопления сигнала 1с,В условиях измерения фосфоресценции Рб-копропорфирина в огличие от условий измерения флуоресценции копропорфирина практически отсутствует фоновый сигнал светорассеяния и свечения образца, Поэтому может быть достигнутазначительно более высокая чувствительность детекции Рб-копропорфирина (порядка 0,1 пмоль/л), Эта величина соответствует чувствительности определения порфиринов, поскольку степень их превращения в палладиевые комплексы практически 100 ф .П р и м е р 3, Способ проводят аналогично примеру 1, но вместо хлорида палладия используют ацетат палладия в той же концентрации, Результаты аналогичны,П р и м е р 4. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют 10 мин при 60 С. Результаты аналогичны П р и м е р 5. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубируют с солью1741028 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 палладия 2 ч при 37 С, Результаты аналогичны.П р и м е р 6, Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубацию проводят в 0,025 М ацетатном буфере, рН 3,0. Интенсивность фосфоресценции снижается примерно в 1,5 раза вследствие неполного перехода порфирина в форму Рб-комплекса.П р и м е р 7. Способ проводят аналогично примеру 1, но инкубацию проводят в 0,05 М ацетатном буфере, рН 6,5. Интенсивность сигнала снижается в 2 раза вследствие неполного перехода порфирина в Рб-комплекс.П р и м е р 8. Способ осуществляют аналогично примерам 1-2, но вместо копропорфиринаиспользуют копропорфирин . Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.П р и м е р 11. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо копропорфирина 1 используют уропорфирин . Фосфоресцентные свойства .соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.П р и м е р 12. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но вместо копропорфиринаиспользуют протопорфирин Х. Фосфоресцентные свойства соединений приведены в таблице. Результаты аналогичны.П р и м е р 13. Определение порфиринов в биологических образцах.В пробирках делают серию разведений стандартного (1 мкм) раствора копропорфирина 1 в О,ОЬ М ацетатном буфере, рН 5,0: 1/1; 1/3; 1/9; 1/27; Добавляют во все пробирки по 0,01 мл раствора РОС (0,01 М) в 0,01 М НС и инкубируютгри 80 С 2 мин на водяной бане. Растворы охлаждают до комнатной температуры и добавляют во все пробирки по 0,1 мл вгдного раствораК 1 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0, содержащего 0,1 мМ соли палладия, добавляют по 0,05 мл исследуемых образцов мочи пациентов (разведение 1:20-1:100 необходимо для снятия влияния компонентов образца на процесс получения Рб-комплексов). Инкубируют 5 мин при 80 С, Затем охлаждают раствор, добавляют 0,1 мл водного раствора сульфата натрия (100 мг/мл), По 0,2 мл растворов переносят в лунки микропланшета и измеряют интенсивности фосфоресценции образцов на импульсном флуоресцентном ридере Агсцз(И/ааК, Финляндия). Условия измерения аналогичны описанным в примере 2, По результатам измерения оценивают уровни порфиринов в моче, используя в качестве контроля мочу здоровых пациентов или калибровку по копропорфирину(см, пример 2). Завышенные уровни порфиринов говорят о нарушениях порфиринового обмена.Производительность способа - около 100 образцов в 1 ч,Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает значительное увеличение чувствительности по сравнению с прототипом (примерно на 2 порядка), позволяет повысить производительность анализа в несколько раз, поскольку время одного измерения мало (секунды), так как нет необходимости записывать спектры, Способ не подвержен влиянию оптических свойств образца и примесей (фоновый сигнал практически отсутствует), легко может быть автоматизирован,Формула изобретения.1. Способ определения биогенных порфиринов, включающий обработку содержащего порфирины образца, измерение его люминесценции и количественную оценку содержания порфиринов по интенсивности люминесценции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения, упрощения и ускорения анализа, образец обрабатывают в буфере с рН 3-6,5 избытком растворимой соли палладия (Рб( ) -) при температуре 37-100 С до полного превращения порфиринов в их палладиевые комплексы, после чего добавляют сульфит в конечной концентрации 5-15 мг/ мл, а количественную оценку осуществляют по фосфоресценции полученных растворов при рН 6,5-8,0 при комнатной температуре.2, Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработку проводят 2-15 мин при 60-80 С в 0,05 М ацетатном буфере с рН 5,0 при концентрации Рб 50-500 мкМ,174102810152025303540Составитель О,БадтиеваРедактор Л.Веселовская Техред М.Моргентал Корректор О.КравцоваЗаказ 2081 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101