Способ получения концентрата глюкозоизомеразы

СООЭ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИН 1) С 12 М 9/92, С 12 Р 19/24 ,(С 12 И 9/92, С 12 К 1:46 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕ 7 2руемой Бгерошусез гиЬ 81 поз.ьз АТСС,21175 с активностью от 200 до 800ИГЕ/мл в качестве осадителя водорастворимой соли сульфата магния и/илиаммония в количестве от 50 до 170 г/лконцентрата, охлаждения смеси до температуры от минус 2 до г;люс 13 С дляускорения кристаллизации, Образовавшиеся кристаллы удаляют, и при желании проводят одну или несколько перекристэллизаций добавлением углеводаили его концентрированного ьодногораствора. Получают концентрат глюкозоиэомераэы с содержанием углеводаот 30 до 60 мас.7, который в дальней"шем может бьть использован для иммобилизации глюкозоизомеразы на материале-носителе в колоночном реакторе,2 з.п, ф-лы,7 (19.06. 27042/28-13 т/РЬ 85/000 .02,86 2549; 85227 .06.84; Об.(72) (53) (54) ГЛЮК (57) ноло ЕНТРАТА техениего повь и целе атр ива т п д зоме ному люкозо получе разы, п еде разь ,конц оду трату глюкозоиз рН раствора устанав х 5, 7-8, предпочти начени и ют в пределано рН 7.Охлаждают раже,Добавляют к эомераэы. повышение акти елевого продук 16 С или ни" ам- от аство сульфат мония. и/или магния в когп 50 до 170 г/л, Количествс зависит от начальной концентраци коэоизомеразы, а также от конеч температуры кристаллизации, Пре тительным является количество д бав- оискозо белков, тельяемог ходит омер Доба ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ й ОТЧРЫГИЯМПРИ ГКНТ СССР 0.06.90 Бюл, У 24уомен Сокери ОЙ (Е 1.)Калеви Юхани Зисури (577,15 (088,8)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЗОИЗОИЕРАЗЬИзобретение относитсяии, Цель изобретенияности и стабильностукта. Способ предусмние кристаллизации гпутем добавления к Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения концентрата глюкозои Цель изобретения ности и стабильности таСпособ получения глюкозоизомеразы осуществляют следующим образом.Иэ нродуцирующих микроорганизмов Бйгерсошусез тцЬ 81 поз з АТСС 2 1175 пизисом бактериальных клеток получают бесклеточный экстракт, подвергают его ультрафильтрации на мембране с проницаемостью на уровне 100000 даль тон, получают концентрат с активностью глюкозоизомеразы от 200 ;о 800 ИГЕ/мл. сульфата, при котором п кристаллизация только глю зы без осаждения других влениесульфата предпочт одят постепенно, тэк чтобавление всей соли занимает 2-4 ч,Но желаемый результат может быть получен добавлением всего количества солиодной порцией, но в этом случае размер кристаллов иэомеразы остается ма"лым,Раствор охлаждают в течение нес"кольких часов до температуры, приближающейся ктемпературе замерзанияконкретного раствора. ТемператураЗамерзания при самой низкой испытанной концентрации сульфата примерно: 2 С и при самой высокой концентрации6 оставляет +16 С, охлаждение можетбыть начато либо с Одновременным добавлением сульфата, либо после добавления сульфата. Путем постепенногоохлаждения достигают эффекта кристаллизация - охлаждение, заключающегося в 20. увеличении размеров кристаллов и втом, что охлаждение уменьшает раствоРимость, чтоприводит к увеличениювыхода.Кристаллы глюкозоизомеразы отделяют путем осаждения их на дно емкости .Фильтрованием или центрифугированием в сепараторах непрерывногодействия,Определенную кристаллическую массу .Осмешивают с сухим углеводам или егоконцентрированным водным раствором,при этом происходит растворение кристаллов глюкозоизомеразы с получениемустойчивого концентрата.Прижелании кристаллизация можетбыть повторена и.в этом случа.е кристаллическая масса,цолжна быть растворена.в большом количестве воды стемпературой 20-30 С,Количество воды должно быть таковым что активность фермента в растворе составляет 500 - 2000 ИГЕ/мл,т,е. количество воды в 4-10 раэ превьппает кристаллическую массу.Полученные концентраты глюкозоиэомеразы представляют собой чистые, устойчивые, удобные в обращении и легкодозируемые препараты. Их активностьможет. регулироваться в пределах от2000 до 5000 ИГЕ/г:.препарата, 50Концентрат глюкозоиэомеразы предпочтительно содержит 30-60 мас.7 растворимого в воде углевода, 5-17 мас.Яглюкоэоиэомеразы, не более 15 мас,7.сульфата аммония и/или магния и/или 55буФера с рН 6-8 и воду.П р и м е р 1. Посевную культуруЗйтерйошусев гцЬ 1 дхповхв ЛТСС 21175 Ферментируют известным способом в 40 кубовом ферментере. Клеточную массулизируют, клеточный остаток удаляютФильтрованием через обычные барабан"ные Фильтры с кремнеземом, получая12 т содержащего глюкозоизомеразуФильтрата, Полученный Фильтрат подвергают ультрафильтрации,через ультрафильтр РС 1 (Раййегзоп - Саару 1 пс,)с проницаемостью на уровне 100000 даль-.тон, получая 3000 кг концентрата глюкозоизомеразы с активностью 960000000ИГЕ, Прошедший через мембрану фильтрат удаляютК полученному концентрату добавляют 120 кг сульфата магния и 300 кгсульфата аммония. Для ускорения кристаллизации,смесь охлаждают до 10. С,Декантированием отделяют образовавшиеся кристаллы и кристаллизацию повторяют добавлением 411 кг воды, атакже 17 кг сульфата магния и 1 кгсульфата аммония, Снова отделяют кристаллы декантированием. Добавлением452 кг воды кристаллическую массурастворяют и прибавлением 1 М раствора аммиака рН раствора доводят до6,5, С помощью пластинчатого фильтрараствор отфильтровывают и кристаллизацию повторяют еще раз добавлением16 кг сульфата магния и 40 кг сульФата аммония,Получают 90 кг кристаллической массы, содержащей 20 кг фермента, 3,7 кгсолей, остальное вода. К кристаллической массе прибавляют 45 кг глюкозыи 45 кг Фруктозы, а также 20 кг инвертированного сахара, имеющего содержание сухого вещества 70 мас.7.В результате получают 200 кг препарата Фермента, имеющего состав, мас.А.:вода, 29,2, сахар 52 глюкозоизомераза 14,5, соль сульфата магния и аммония 4, 3,Активность глюкозоизомераэы в концентрате 4500 ИГЕ/гП р и и е р 2, По методике примера 1 готовят ультрафильтрованный Ферментат К 4000 кг его прибавляют244 кг кристаллического сульфата аммо"ния, а затем раствор сульфата аммония, содержащего 600 кг соли в 900 лводы. Раствор охлаждают до 13 С и вьюдерживают при этой температуре 20 ч,Образовавшуюся кристаллическую массу отделяют в сепараторе фирмы ВестФалиа-Юа. Коисталлы растворяют вводе и полученный раствор отфильтровы1575946 5вают с получением 2000 л фильтрата,Кристаллизацию повторяют использова-нием 122 кг кристаллического сульфа-.та аммония в растворе сульфата аммония, содержащего ЗОО кг сульфата аммония в 460 л воды, Полученную кристаллическую массу вновь отделяют всепараторе. К 525 кг кристаллическоймассы прибавляют такое же количествофруктозы кристаллической, затем полученная масса растворяется с частичнойизомеризацией фруктозы в глюкозу,Получают концентрат, содержащий,мас, .: сахар 50; Фермент 11,2, сульФат аммония 3,5; вода 35,3. Актив"ность глюкоэоизомераэы в концентратесоставляет 3000 ИГЕ/г.П р и м е р 3. По методике примера 1 приготавливают 4000 л ультраФильтрованного Фермента с активностью 240000000 ИГЕ. 57-ным растворомЫаОН рН доводят до 7,0, температуруустанавливают равной 12 С,Для кристаллизации глюкоэоиэомеразы в 750 л воды растворяют 500 кгсульфата аммония и полученный растворприбавляют в течение 2 ч при равно-.мерной скорости прибазления. Получен-ный раствор охлаядают до -2 С и перемешивают 24 ч. В сепараторе ВестфалияИаотделяют кристаллы глюкоэоиэомераэы. Выход кристаллической массысоставляет 290 кг при содержании вней 23,6 мас,7 сухого вещества и активности 2300000000 ИГЕ. К кристаллической массе добавляют 30 кг хлориданатрия и 180 кг глюкозы, рН полученного концентрата Фермента устанавливают 7,0 добавлением 5%-ного раствораЯаОН, при этом глюкоза частично изомеризуется. Получают 600 кг устойчивого концентрата Фермента, содержащего, мас.Х: вода 49,7; сахар 30; Фермент 12,8; сульфат аммония 2 5 и хлорид калия 5. Активность глюкозоизомеразы в концентрате составляет 3400 ИГЕ/г,П р и м е р 4. По методике примера 1 получают 4000 л ферментата с активностью 240000000 ИГЕ. Добавлением 5%-ного раствора устанавливают рН раствора 7,0, температуру " 12 С. Для кристаллизации глюкозоизомеразы в 750 л воды растворяют 500 кг сульфата аммония и полученный. раствор прибавляют в течение 2 ч при равномерной ,скорости подачи. Декантированием отделяют кристаллы глюкоэоиэомеразы. бПолучают 230 кг кристаллическоймассы, содержащей 40 мас.7 сухих ве-,.ществ с активностью 2300000000 ИГЕ, 5К кристаллической массе добавляют115 кг глюкозы и 115 кг фруктозы, атакже 50 кг инвертированного сахарас содержанием 70 мас.сухого вещества, Получают. 510 кг концентрата глюко.эоиэомеразы с содержанием, мас.%:вода 30; сахар (глюкоза, фруктоэа)52; фермент 15, 1; сульфат аммония 2,9,Активность глюкозоизомеразы в концентрате составляет 4500 ИГЕ/г.П р и м е Р 5. По методике примераполучают ультрафильтрованный концентрат глюкозоизомеразы, При 25 С ко0,95 л концентрата нзомераэы с актив"ностью 600 ИГЕ/мл, прибавляют 50 г 20 суг ьфата аммония, На этой стадии ненеблюдается брзвания осадка. Раствор охлаждают 16 ч при О С и выдержиавают при этой температуре при мягкомпостоянном помешивании,Через два дняначинают выпадать кристаллы изомераэы, кристаллизация продолжается таким образом, что через пять дней97,5 мас,иэомеразы находятся в кристаллической форме и только 2,5 мас.7все еше в растворенной Форме в маточном растворе, С помощью лабораторнойцентрифуги кристаллы отделяют от раствора, получая 56 г влажной кристаллической массы.Как видно иэ примера, можно выкоис таллизсвать иэомеразу при очень низкой концентрации сульфата аммония посравнению с количествами, рекомендованными литературными источниками.В то же время данный пример является 4 О примером кристаллизации только поддействием охлаждения. В свете данногопримера легко понять, что если осаж-.дение под действием сульфата аммонияпроводить бь:стро и после этого сразу 5 же, например через 15 мин, отделятьосадок в центрифуге, изомераза полностью остается в растворе при применениинизкой концентрации сульфата аммония,но даже если изомераза осаждается, 5 О ее кристаллизация не наблюдается ипреимущества кристаллизации остаются неиспользованными, Кристаллическаямасса приготовленная в соответствиис настоящим примером, может быть раст ворена точно также, как и в другихпримерах.Концентоат глюкозсизомеразы, полученный согласно изобретению, используют для иммобилизации глюкоэоизоме1575946 разы на материале-носитепе в колэночном реакторе. Составитель ИПривалова Редактор Л,Пчолинская Техред АКравчук Корректор Н,Король Заказ 194 Тираж 481 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб. д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Формула изобретения5 1, Способ получения концентрата глюкозоизомеразы, предусматривающий культивирование продуцирующего глюкозоизомеразу микроорганизма Бсгерйошусез гпЬ:ц,.позэ АТСС 21175 на питательной среде до достижения максимальной активности, отделение биомассы, лизис клеточной массы с получением бесклеточного экстракта, очистку и концент рирование экстракта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения активности и стабильности целевого продукта, очистку и концентрирова- ние экстракта Фермента ведут ультраь фильрацией на мембране с проницаемостью на уровне 100000 дальтон с получением концентрата активностью 200 - 800 ед ИГЕ/мл, Фермент выделяют осаждением водорастворимой солью сульфа та магния и/или аммония в количестве 50 " 170 г/л концентрата, смесь охлаждают до температуры от минус 2 до плюс 13 С, способствующей кристаллизации, полученную кристаллическую массу отделяют декантираванием, кристаллы растворяют в воде и перекристаллизовывают один или несколько раз, к кристаллической массе добавляют у:глевод в виде кристаллов и/или концентрированного раствора в количестве, обеспечивающем содержание его в целевом продукте от 30 до 60 мас,7,2. Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что Фермент выделяютиз концентрата добавлением вначалекристаллического сульфата аммония,а затем раствора сульфата аммония вкачестве осадителя с последующим охлаждением, полученную кристаллическую массу отделяют и перекристаллизовывают растворением в воде. полученный раствор фильтруют и добавляюткристаллический сульфат аммония и егораствор, образованную кристаллическуюмассу отцеляют и смешивают с фруктозой.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что Фермент выделяютиэ концентрата добавлением сульфатамагния, сульфата аммонИя и охлаждением, полученные кристаллы отделяютдекантированием и перекристаллизовывают добавлением воды, сульфата магния и сульфата аммония, рН доводят до, 6, 5 добавлением разбавленного аммиака.и перекристаллизацию проводят добавлением сульфата магния и сульфатааммония, а затем к кристаллическоймассе добавляют глюкозу, Фруктозу иводу с образованием целевого продукта.Приоритет по пунктам и признакам:25.06,84 по пп, 1-306,06.85 по н,25,06,84 - Фермент выделяют осаждением водорастворимой солью сульфатамагния и/или аммония в количестве 50170 г/л, а смесь охлаждают от -2 до