Способ замораживания эмбрионов кур

1551315 4 Табли ца 1 Жизнеспособность эмбрионов при продолжительности выдержки, мин1 "l. центра крио- екто 0 0 0 0 0 1 7 1610 19 13 2112 20 6 7 25 18 желточной оболочки эмбрион пипеткойс ереносят в другую чашку Петри с 824 фС -пропиленгликоля на растворе Говарда, выдерживают 5-10 мин, затем Переносят в контейнер для замораживания, в качестве которого импользуют к примеру алюминиевый цилиндр диаметром 11 мм и высотой 2 мм.Эмбрион в контейнере в укаэанном 8-12/-ном растворе криопротектора охлаждают со скоростью 50-60 град/мин о начала процесса кристаллизации, ыдерживают в течение 25-35 с и замоаживают до (-18)-(-22) С со скорос ью 30-35 град/мин и до -79 С со коростью 95-105 град/мин. Скорость охлаждения контролируют с помощью контрольно-измерительного устройства, к примеру термопары, подсоединенной 20к самопишущему потенциометру ЛКС- 003. Замороженные эмбрионы хранятри -79 С, используя в качестве хлад- агента твердую углекислоту. Разморажи вание проводят путем помещения кон гейнеров с эмбрионами, в раствор Говарда при 18-22 С. После этого эмбрион выдерживают в течение 5-10 мин в солевом растворе (растворе Говарда) для отмывки его от криопротектора. Перед размораживанием эмбрионаподготавливают желточную оболочку, Вначале ее отделяют от желтка (используют пищевые, неоплодотворенные, а также любые другие дешевые яйца), Для этого на желток накладывают кольцо из Фильтровальной бумаги, врутренний диаметр которого на 2-3 мм должен превышать наружный диаметр используемого для культивирования ка меры. Под кольцо инъецируют физраствор в количестве до 5 мл, а затем обрезают желточную оболочку по наружной стороне кольца и переносят в чашку Петри с Физраствором, С помощью 45 скребка очищают желточную оболочку от остатков желточной массы и укладывают внутренней стороной вверх на камеру для культивирования, Камеру для культивирования перед этим заполняют питательной средой, как и в известном способеРазмороженный эмбрион пипеткой с расширенным до 4-5 мм концом переносят на желточную оболочку. При этом стремятся к тому, чтобы эмбрион лег на желточную оболочку дорсальной стороной. Если же он лег вентральной стороной или завернулся, тонкой стеклянной палочкой приводят его в нужное положение. Затем с помощью тонкой пипетки удаляют остатки .Физраствора вокруг эмбриона. После этого проводят культивирование эмбриона известным способом. Первый контроль за развитием эмбриона проводят через 12- 14 ч культивирования.В описании приведены данные, обосновывающие граничные пределы продолжительности выдержки эамбрионов в растворе криопротектора до замораживания и в соленом растворе после размораживания, а также режима охлаждения, выдержки в течение периода криса таллизации и замораживания до -79 С.Устойчивость эмбрионов к замораживанию зависит и от продолжительности их выдержки в процессе кристаллизации. При выдержке в течение 25-35 с 25-63 эмбрионов сохраняют жизнеспособность, тогда как при выдержке менее 25 с число жизнеспособных составляет 3-53, а более 35 с - 15-183.Жизнеспособность, 3 от общего числар деконсервированных эмбрионов в зависимости от продолжительности контакта до замораживания с криопротектором в различной концентрации приведена в табл. 3 3 7 10 24 1 7 12 13 24 20 15 12 23. 19 11 923 18 8 618 15 661Продолжение тэбл,2 5Жизнеспособность деконсервированныхэмбрионов, 3 от их общего числа, взависимости от скорости охлаждениядо начала процесса кристаллизацииприведена в табл, 2,1551315 26 25 20 18 Табли ца 2 С корост ь охлаждения,град/мин Опыт Количество эмбрионов,Жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, Ф к их общему числу, в зависимости от скорости их заморажи 1 Ь вания от начала процесса кристаллизации до (-18)-(-22) С приведена в табл. 3. 2 3 30 40 23 22 23 Табли ц,а 3 Опыт Скорость замораживания,град/мин-17 -18 -20 -22 -23 -25 Выход, 3, жизнеспособных эмбрионов в зависимости от скорости их замораживания от (- 18) -(-22) С до -79:С приведен в табл, 4,растворе после размораживания приведена в табл. 5,Та бли иа 5ю 40 ОпытТа бли ца 4 Количество эмбрионов, Ф Продолжительность выдержки, мин Опыт Скорость замораживания, град/мин Количество эмбрионов,3 451тпа457 В табл. 6 приведены данные сравнительных испытаний эффективности замораживания куриных эмбрионов известным и предлагаемым способами. Они свидетельствуют о существенном преимуществе предлагаемого способа перед известным. Прикрепляемость эмбрионов к желточной оболочке в зависимости от продолжительности их вьдержки в солевом 1 2 3 4 5 6 7 20 25 30 35 40 50 80 90 95 100 105 110 115 9 7 8 5 5 4 21 23 .25 25 26 24 20 12 .10 9 8 8 6 5 4 5 6 71551315 Табли ца 6 Количество эмбрионовсохранивших жизнеспособность после разморажи ва ния Способ замораживания Заморожено эмбрионов,шт,Г шт. 16,7 26,0 ИзвестныйПредлагаемый 30 71 формула изобретения Составитель И.ТарееваТехред 31.Сердюкова Корректор М.Максимишинец Редактор В,Данко Заказ 288 Тираж 434 Подпис ноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКЙТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб;, д. 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент, г, Ужгород, ул. Гагарина,101 Способ замораживания эмбрионов 1 ур, включающий отделение эмбрионов Ьт желтка, отмывку от желточной масго ы, выдержку в растворе криопротектора, охлаждение, о т л и ч а юЩ и й с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности эмбрионов, ис пользуют эмбрионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, дополнительно проводят отделение от желточ"ной оболочки, в качестве криопротектора используют 8-123-ньсй растворос.-пропиленгликоля, выдерживают в течение 5-10 мин, охлаждение ведут втри стадии: вначале со скоростью50-60 град/мин до начала кристаллизации,при которой выдерживают 25-35 с,азатем со скоростью 30-35 град/миндо (-18)-(-22) С и со скоростью 95105 град/мин ио -79 С.