Способ криосохранения генофонда сортов и видов картофеля

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУ БЛИН 52442(51;.5 С 12 Ы 5 00 ТЕНИ и растений Научно-производпо картофелевод" ФСР о Р.Г., и алексобност я ФиЗО Рб е отокк зиес живал 3, т,НОФОНДА биотеым мет кане ой с ульт ГООУДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТПО ИЯОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГНИт ССООПИСАНИЕ ИЗО К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Институ". физиологим. К,А.Тимирязева иственное объединениеству Госагропрома РС(56) Ианжулин А.В., БуПопов А.С. Влияние подсов картофеля на их жнпосле глубокого заморазиология растений, 198с. 1188.(57) Изобретение относитсянологии, а именно к криогедам хранения живых клеток Изобретение относится к биотехнологии, а именно к криогенным методам храпения живых клеток и тканей растений, в частности алексов (меристематических верх,шек побегов) и може быть использовано в селекции н семеиоводстве для длительного сохранения генофонда картофеля.Целью изобретения является повышение надежности криосохранения, увели" ченне жизнеспособности апексов и обес лечение генетической идентичности ре" генернрованных растений исходным,Способ состоит в том, что в качестве исходного материала для вычленения апексов берут заведомо здоровые стерастений, в частности меристем,и может быть использовано в селекции исеменоводетве для длительного сохранения генофонда картофеля. Цельюизобретения является повыиение надежности криосохранения, увеличение жизнеспособности апексов и обеспечениеидентичности регенерированных растений исходным. Способ состоит в том, что в качестве исходногоматериала для вычленения апексов берут заведомо здоровые стерильные растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в раствор криоиротектора вводят дополнительно сахарову в концентрации 5-103, в питательную среду вводят аделин в концентрации 10"40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стеба, одновременноис:ночая из среды ауксины и гидролизат казеина. 3 табл. рильны растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в раствор криопротектора дополнительно вводят углеводы, в частности, сахарову в концентрации 5-ОХ, в питательную среду вводят дополнительно аденин к концентрации 10-40 мг/л, ви таиины добавляют по прописи Стаба, о повременно исключая из среды ауксины н гидролиэат казвина,Сущность изобретения заключается в замене исходного материала для выделения апексов на наиболее высококачественный в модификации питательн реды для их предварительногоивирования и рекультивированияпосле оттаивания и.введения дополнительных, помимо ДИСО криопротектосров, в качестве которых испольэуктся углеводы в частирстн сахароза в конВ5 центрации 5"1 ОХ. Наиболее высококачвствениый материал представлен коллекциями вполне оздоровленных стерильных растений в пробирках, имеющихся во всех селекцентрах и мировых цент-10 рах генофонда картофеля и насчнгывающих сотни и тысячи различных сортов и форм. Такие коллекции являются непременным этапом современнага интенсивного семеноводства картофеля и поддерживаются клональным микроразм.ножением в строго контролирусяъ лабораторных условиях, т.е. они аксимально стандартизованы. При их использовании исключается стени,.изация проростков перед вычленением из них апексов. Модификация питательной среды для апексов, с одной стороны, ослабляет рост их клеток растяжением в период предкультнвирования, что уменьшает вакуолиэацню и овадненность клеток и благоприятно для ж выжива-, ния во время экстремальной процедуры глубокого замораживания и посиедующего оттаивания. С другой сторонь,1 предлагаемая модификация палносгъю предотвращает каплусообраэование в период рекультивироваиия после оттаивания, обеспечивая толька прямую регенерацию, Введение в состав раствора криопротектора углеводов, в частности,35 сахарозы, каждая молекула которой связывает четыре молекулы воды, не только уменьшает токсичность ПМСО, на и увеличивает вязкость раствора, сокращая объем образования льда, скорасть его распространения и вероятность повреждения им клеток. Одновременна, проникая вслед за Р 1 СО в лет" ки, углеводы связывают воду и внутри них, предотвращая чрезмерное сжатие протапласта в процессе медленного замораживания, Снабжение пакета с алексами фитилем н его расиоложевиепозволяет максимально снизить объем раствора в ампуле значительна уско.ряя оттаивание, чта сокращает вероя; - ность повреждений ца этом этапе эа счет роста возникающих при .;окажи. ванин центров кристаллизации.Способ иллюстрируется принс рами. 55Дчя замораживания используя,т аиел сы размером 300-450 мк:1, вьз, . иь из пазух листьев средней части .".б-.Ядневных стерильных растений культурного тетраплоидного вида картофеля сорта "Да;лодедовский". Предварительная подготовка апексов заключается в кугьтивировании их на жидкой питательной среде, модифицированной, как указано льшие, н течение 24-26 ч, причем последние 16 ч иэ этого срока в присутствии добавленных к среде криопро" текторов". 53 ДМСО и 5 Й сахароэы. Условия культивирования растений: темпе" рату 1 та 22"23 С, влажность 60-70 Ж, освещенность - 5-8 тыс лк, фотопериод.о16 ч/сут; аиексов: 26 С, влажность 60-753, освещенность 5-8 тыс.лк, фото- период - 24 ч. После подготовки апексы в пакетике иэ фильтровальной бума" ги, снабженном фитилем, переносят в ампулу под пробку, располагая пакетик вдоль боковой стенки так, чтобы фитиль и пакетик прилегали к ней вплотную и фитипь опускался дс дна. В ампул" наиивают 0,2-0,3 мл вьшеуказанного раствора криопротектороь, охлаждают ампулы в ледяной бане, а затем в ирограммнам эаморажнвателе со скорос,ью 0,5 О С/чин. При температуре -4,5 С производит затравку сразу всех ам пул, наход щих я в сиециалъном штативе, путем ирихосвсвеиия их дна к поверхности жидкого азота в течение 0,8 л 0,3 с, Дпя затравки возможно также использование специального устройства. ,ели программный эамараживатепь оснащен и адсонылл стройством, которое позволяет избежать кратковременного нарушения режима в камере замораживания. В обоих случаях апексы отдалены от завы образования и первоначального быстрого рос га кристаллов льда в момен. затравки и не мо 1 ут быть повреждены в этот момент. После этого темпсратуру ь камере замораживания поддерживают на уровне -5 С в течение 1 О мии, а затем продолжают охлаждение с иервоначальной скоростью доо-40 С, после чего сразу погружают в жидкий азот (-196 С), После хранения в жидком азате ампулы быс тра раэморакнвают, стряхивая в воде при 40 С, затем алиулы в ледяной бане быстро переносят в стерипьиые усповия и алексы выса;кивают на агаризаваэную среду торс же с става. Условия рекультивировапия в и рва е сутки такие же, каки для ирдк;иьти 1 р лвания аваксов, но сива.еиваст - от 100 да ОООО лк.1 ереэ 2-е в, на сгедуощие с.,тки и в1524479 5 6 дальнейшем через каждые 5-7 дней апек- бель Разделяют на микрочеренки, котосы пересаживают на свезув вгаризован- рые переносят в пробирки для укореную среду, продолкая рекультивирова- нения.ние в условиях, указанных выше для В табл.приведены результаты, порвстений. После возобновления роста лученные по предлагаемому способу, в и развития и образования сильного ете- зависимости от состава раствора крио" лющегося по чашке стебля, этот сте- протекторов.Таблица 1Влияние состава криопротекторов на киэнеспособностьапексов и регистрацию растений Вариант Конечная концентрация криопротекторов, Й Количество апексов, Х ДИСО глицерин сахароза образовавшихкаллус вьвкивших регеиерироваввикрастения в теч,мес,Таблица 2 Влияние возраст исходных стерилькых растений кн выход растенийрегекераптсв после глубокого эаморавкванкя и оттаивания апексов Возраст исходныхрастений, дни Число апексов, регенерировавшихрастеккя 3 26 28 32 36 41 82 33 14 О 4 Таблица 3Влияние содерканкя аденинн в питательной среде на скоростьроста регеиерантов иэ меристем картофеля Длииа регекерантов (мм/месяц) Вариант содержаниеаденина всреде, мг/л) сорт Домодедовский мм 7. к конт- ролю сорт Друзиый сорт Славянский мм Х к конт- ролю Х к конт"ролю мм 1,356 2,563 3,005 5, 06 6,44014 2,595 3,59 5, 300 6,483 89,0 221,6 376,5 474,9 1,2 О 2,7003,103 6,725 6,73 232,9 315,9 475,8 582,0 223, 1 256,4 555,8 555,6 Контроль:беэ аденинаО,55,010,020,0 5 О 5 О 5 0 5 . 0 5 5 5 5 21524479 Продолжение табл.3ЮВе, .Чеещ ЩЮФЩВариант (содержание аденина в , среде, мг/л) юйюф Длина регекерантов (мм/месяц) сорт Дружный сорт Славянский сорт Домодедовский мм Е к конт"ролю Х к контролю 2 к контмм родю 40,0 60,0 80,0 НСР 7,157 4,918 4,205 0,487 59406,4347,5402 6,71 4 188 3 ю 515 0,572 602,4375,9315,551,3 7,500 4,710 з,475 1,202 553,347,3403,888,6 Формула изобретения Составитель В. ДамкинТехред Д.Сердюкова Корректор О, Кравцова Редактор Н, Козлова Заказ 4 ЗЬЗ Тираж 486 ПодписноеВИИИПИ Государственного комитета по изобретениям к открытиям при ГКНТ СССР113035, Иосква, Б, Раушская наб., д. 45/ Проиэводственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород ул. Гагарина,О 1Таким образом, иэ табл, 1:, в:гдно, что предлагаемый способ езко выделяется по числу растений-регекерантов й позволяет полностью исклю кть обрастание выживших апексов калиусной тканью - все выжившие показывают прямую, регенерацию в растении для сорта пДомодедовский" число вьгжившкх апексов 823 и число растений-регенеран тов также 823. Характер развития апексов не оставляет сомнений в г рямой регенерации, что исключает необходи" кость в проведении сложной к трудоем" кой процедуры идентификации генотипа 30 полученцьпг растений, Следовательно, предлагаемый способ, обеспечивающий высокий выход растений-регекеранточ и экономию труда и средств, расходуемых на поддержание лабсраторвых л ,полевых коллекций со 15 тв, форм и видов картофеля, пс сравнению с аналогами является существенно.менее трудоемким; так как пе требует викул сложной конструкции, которую ягкходктся изготовлять .и монтировать вручную и затем стерилизовать ам.-гули, позволяет .,исключить операции кмк феской стерилизации и последующей трехкратной промывки проростков клубней к по-лучать всегда заведомо вполне здоровый материал для размножения к селекции, исключив сеэонные перерывы в работе к спасность инфицирования сбразцов поверхчостной микрофлорой клуб 50 невых проростков. Способ криосохранения генофонда сортов н видов картофеля, включающий предварительное культивирование апек" сов растений на питательной. среде, . содержащей микро- и макроэлементы по, прописи,Иураскге-Скуга, размещение кх ,. ампулах, программное замораживание в упаковке в присутствии раствора кркокротектора с затравкой кристаллизации этдго раствора и последующей стабилизацией температуры до момента распространения кристаллов по всему объему раствора, ,ранение при темпеоратуре ниже -140 С о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с иелью повышения и:,цежностк крносохранения, увеличения жизнеспособности апексов и нбсспеченкя генетической цдентичностк регенерированных растений, в качестве исходного материала используют 26-28-дневные стерильные растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в раствор криояротектора допнлнительггн вводят сахврзэу в конценграцин 5-Ой, в питательную сзеду дополнительно вводят адензн в количестве 10"40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, а в качестве .упаковки для замораживания апексов используют пакет кэ фильтровальной бумаги, снабженный фитилем, по длине равным высоте ампулы.