Способ определения изоэлектрической точки биологической ткани

(71) Курский госудацинский институт(56) Руководство княтиям по физиологМ.: Просвещение,и растений.68, с. 8- 12.(54) СПОСОБ ОПРЕ ЧЕСКОЙ ТОЧКИ БИО (57) Изобретение ти биологии и ме ДЕЛЕНИЯ ИЗОЭЛЕКТРИ ОГИЧЕС Кой ТКАНИ относится к облас ицины - к способамектрической точки предел иологи римене ия изоэ ских тк ей, и может, бытьке клинических,в пр ических, ветерина ко-токсико то ра игается т об ел ме ци хими ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР Н АВТОРСКОМУ СВИ ие относится к биологии а именно к способам определения изоэлектрическои точки биологических тканей, и может быть применено в практике клинических, химико-токсикологических, ветеринарных лабораторий, в сельском хозяйстве, а также при изолировании веществ из биологических тканей на заводахко-фармацевтической промышленности, при проведении биотехнологи" ческих исследований. Способ относится к числу массовых.Целью изобретения является повышение точности и возможности определения изоэлектрической точки гни" лостной ткани. 2ных лабораторий, а также при изолировании веществ из биологических объектов на заводах химико-фармацевтической промышленностиЦель " по" вышение точности способа. Для этого ткань гомогенизируют, фиксируют 702-ным этиловым спиртом, окрашивают раствором эозина, избыток которого отмывают до получения бесцветных смывных вод, и раствором метиленового синего, избыток которого также отмывают водой. К отмытой ткани добавляют буферные растворы со значениями рН 1,00 - 9,00, затем раствор отфильтровывают от осадка, а филь- трат фотометрируют при длинах волн 540 и 590 нм, Изоэлектрическую точку ткани определяют графически и находится она между минимумами свето- поглощения окрашенных растворов.3 табл. тельную или животную ткань измельчают 5 мин при 5000 об/мин, берут-б точные навески, окрашивают 4 10 М эоэина и 4 10М метиленового синего, отмывают краситель дистиллированной водой, затем помещают ткань в бу. - ферный раствор Бриттона-Робинсона на 10 мин при соотношении ткань: раствор 1:5, отфильтровывают, измеряют оптическую плотность фильтрата при длинах волн 540 и 590 нм и интервалы иэоэлектрической точки определяют графически по минимумам светопоглощения растворов.Способ осуществляют следующим образом.1504592Биологическую ткань измельчают 5 мин при 5000 об/мин на микроизмельчителе ткани РТ; берут точную навеску, фиксируют 707.-ным этиловым спиртом, окрашивают раствором эозина, избыток которого отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов и раствором метиленового синего, избыток которого также отмы О вают, к отмытой ткани добавляют буферный раствор Бриттона-Робинсона со значениями рН 2 - 9 на 10 мин при соотношении ткань:раствор, равном 1:5, затем раствор отфильтровывают 15 от осадка, окрашенный фильтрат фотометрируют при длинах волн 540 и 590 нм, Интервал изоэлектрической точки ткани определяется по минимуму светопоглощения растворов при 20 540 и 590 нм.П р и м е р 1. Определение изоэлектрической точки свежей ткани печени. 100,0 г печени измельчают на микроизмельчителе ткани РТ5 мин при 5000 об/мин. В 9 пробирок помещают по 1,0 г (точная навеска) ткани печени, добавляют по 5 мл 707-ного этанола, тщательно перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего спирт сливают, а в каждую пробирку добавляют по 3,0 мл 0,17-ного водного раствора эозина, перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистилли рованной водой до получения бесцветных смывов. Затем в пробирку добавляют по 3,0 мл 0,05 Е-ного раствора метиленового синего, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин для 40 окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов, В каждую пробирку прибавляют универсальную буферйую смесь Бриттона-Робин сона со значениями рН 3, 29, 4, 10, 4, 56, 5, 02, 5 ь 331 бю 09 ю бю 59ОО, 8, 86, перемешивают и оставляют на 10 мин, после чего жидкость сливают с осадка, фильтруют и фотометрируют на приборе КФК в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм при светофильтрах с длинами волн 540 и 590 нм. По результатам измерения строят кривые зависимости оптической 55 плотности окрашенных буферных растворов от величины рН, Интервал изоэлектрической точки свежей ткани печени определяют по минимумам свето- поглощения растворов при 540 и 590 нм.Результаты определения иэоэлектрической точки свежей ткани печени приведены в табл, 1.П р и м е р 2. Определение изоэлектрической точки гнилостной ткани печени. 100,0 г гнилостнЬй печени (3 мес) измельчают на микроизмель" чителе ткани РТ5 мин при 5000 об./мин. В 9 пробирок помещают по 1,0 г (точная навеска) ткани печени, добавляют по 5,0 мл 707.-ного этанола, тщательно перемешивают, оставляют на 10 мин, после чего спирт сливают, а в каждую пробирку добавляют по 3,0 мл О, 17-ного водного раствора эозина, перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов. Затем в пробирку добавляют по 3,0 мл 0,05 -ного водного раствора метиленового синего, тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин для окрашивания. Избыток красителя отмывают дистиллированной водой до получения бесцветных смывов. В каждую пробирку прибавляют по 5 мл универсального буферного раствора Бриттона-Робинсона со значениями рН 3, 29, 4,10, 4, 56, 5, 02, 5, 33, 6, 09, 6, 59, 7, 00, 8, 36 перемешивают и оставляют на 10 мин, после чего жидкость сливают с осадка, фильтруют через бумажный фильтр и фотометрируют окрашенные растворы на приборе КФК в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм при светофильтрах с длинами волн 540 и 590 нм. По результатам имере" ний с.троят кривые зависимости оптической плотности окрашенных буферных растворов от величины рН. Интервал изоэлектрической точки гнилостной ткани пече и определяют по минимумам светоп, глощения растворов при 540 и 590 нм.Результаты определения изоэлектрической ткани печени-гнилостной приведены н табл, 2.Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов приведена в табл, 3.формула изобретенияСпособ определения изоэлектрической точки биологической ткани путем5 1504592 6приготовления препарата, окрашивания метиленового синего в течение Т 0 минего последовательно эозином и мети- каждым красителем, затем отмываютленовым синим, с последующей регист- краситель водой, добавляют к тканирацией изменения окраски и расчетом . буферный раствор Бриттона-Робинсона5величины рН, о т л и ч а ю щ и й с я при соотношении ткань:раствор 1:5,тем, что, с целью повышения точности выдерживают смесь 1 О мин, отфильтрои воэможности определения изоэлектри- вывают и измеряют оптическую плотческой точки гнилостной ткани, ткань ность растворов при длинах волн 540предварительно измельчают, окрашива и 590 нм с последующим расчетом венке проводят 4 10 М эозина и 4 10 М личины рН,1 Таблица 1 2 точка У 1 точка пп рН МетролоТгические рН Метроло- гические характеристики характе- ристики 6,09 Х6,09 6,096,096,096,09 5,02 Х = 5,14 5,33 Я0,03 5102 Ях 0 О 1 5,02 с =0,03 5,33 А = +0,583 Таблица 2 2 точка У 1 точка рН Метроло-. гическиерН Метроло- гические характеристики характеристики 5,33 Х = 5,14 5,02 Я = 0,17 5,02 Я, = 0,08 5,33 А = +4,287 4,56 Х = 4,19 4,10 Б = 0,21 4,10 Б = 0,09 4,10 Я 0=0,25 4,10 А = +5,977. Таблица 3 Сравниваемйе параметрыИзвестный Предлагаемый Свежая ткань печени Подготовкапробы Измельчение Гистологичес"кий срезКоличественно ПроизвольноСубъективноОбъективно (визуально) Взятие пробыОценка результатовСпособ Предлагаемый Извес тгый Область иэоэлектрической точки одного образца, рН Относительная ошибка, Х, для точки:12 5,14-6,09 4179 6 ф 07 112,11 +15,65 10,58Результаты5 измеренийсовпали Доверительныйинтервал дляточки12 0,58 0,95 0,03Результаты5 измерений совпали Гнилостная ткань печениПробу взять невозмокно,4,19-5,14 иэоэлектрическая точка не Область иэоэлектрической точки, рН определяется Относительнаяошибка, 7, дляточки12Доверительныйинтервал дляточки:12+5,97 +4,28 0,25 0,22 Составитель А. ПоповТехред М.Дидык Корректор М.Поко Редактор Н, Горват Заказ 5247/46 Тирак 789 ПодписноеВНИИПЬ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раущская наб,д. 4/5 Праиэводственно-издательский комбинат "Патент", г.укгород, ул. Гагарина,101