Способ определения активаторов плазминогена

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК 50 14 П 9) б 11 4 С ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЬГГИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 00633/ .07,86 13 Бюл. 0 14й научно-исс.04.89.лорусский инститбиологии эпидемиологи ров и Н.С.Пыжова(56) ЬоЬ 1 К.С;, Бз.пз.о т. 1 пя К,С Иеьподз аког зцй 1 щ Е 11.с райыау сошропепйз 1 п аз ТЬготпЬ. Кез, 1982, 27, 5Баскова И,П. Практикум по фи гической химии. И.: Изд-во МГУ, с, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВАТ ПЛАЗМИНОГЕНА(57) Изобретение относится к прикладной биохимии и может бвано в производстве пр ша,89-91.ОРОВ рую плас На обе п миногенаоФпри 37 С. ктиватора пла следуемо и инкуби По оконч щадь зон (мм ) и миногена уют в термостат нии инкубации и лизиса на обеих еряют плоластинахоры плазыть использоепаратов актиа также при ла пределяю вычитая тина торов плазминоге из площади зсныблученной пластине на облученной ораттаза ом изучен фибринолилючается в емо- етесостояния а на не ибриноллощадьластине а. Цель изповышении он лизи 1 ия за чности та Изобретение относится к прикладой биохимии и может быть использова м изучении состоябринолиза, а также репаратов активато но при ла ния гемос рато за и мля ств ри произ ов плазмЦель и огена.бретенияба. повышение точедставлены зоны лиост Нспос ер иса,Способразом,В двуовые пл готовят фибримешивания в шка е тины путем(21) 4 (22) 2 (46) 1 (71) Б тельск и микр (72) В (53) .6 осуществляется следующим способа, Способ состоит в том, что готовят две фибриновые пластины путем смешивания раствора человеческого фибриногена, содержащего плазминоген, и раствора тромбина, выдерживания их при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем одну из пластин для инактивации плазминогена подвергают ультрафиолетовому облучению до энергетической экспозиции 1,4 2,6 Дж/см , при этом расстояние между пластиной и источником излучения устанавливают равным 35-45 см, Втотину облучению не подвергаютластины наносят раствор исрасчете на 1 чашку 9 мл О,ЗЕ-ногораствора, содержащего плазминоген человеческого фибриногена на 0,85 Еном растворе хлорида натрия и 0,2тромбина (400-800 ед), выдерживанипластин при комнатной температуре втечение 30 мин для формирования фибрина инактивации плазминогена в одной иэ пластин облучением фибриновойпластины ультрафиолетовыми лучамидо экспозиции 1,4-2,6 Дж/см , приэтом расстояние между пластиной и источником излучения устанавливают равным 35-45 см.рован,Стрептокиназа - истинный активатор плазминогена и действие ее проявляется только на плазминоген, Лонголитин - протеиназа, проявляющая свойства и активатора плазминогена ,ч фибринолитической протеиназы. В случае стрептокиназы и лонголитина ,активаторная активность равна соответственно 412 и 88 ммй 50 При ультрафиолетовом облучении в заданном режиме избирательно инактивируется иммобилизованный на фибрине плазминоген, тогда как свойства фибринового геля полностью сохраняются, На необлученную и облученную пластину. наносят-по 0,03 мл раствора исследуемого активатора плазминогена и инкубируют их в термостате при 10 37 С в течение 20 ч. Затем измеряют площадь зон лизиса на обеих пластинах и определяют активаторы плазминогена, вычитая из площади зоны лизиса фибрина на необлученной пласти не площадь зоны на облученной пластине.11 р и м е р 1, В 2 чашках Петри готовят фибриновые пластины, смешивая в расчете на 1 чашку 9 мл 0,37. в но 20 раствора, содержащего плазминоген человеческого фибриногена на 0,853-ном растворе хлорида натрия и 0,2 мл раствора тромбина (400 ед). Пластины выдерживают при комнатной температуре 25 30 мин для формирования фибрина, Одну из пластин подвергают ультрафиолетовому облучению с помощью облучателя ртутно-кварцевого настольного ОКНпри 20 С в течение 10 мин под 30ауглом 90 к плоскости пластины на расстоянии 35 см от нее, Затем .на обе пластины наносят по 0,03 мл раствора стрептокиназы (500 МЕ) и по 0,03 мл раствора лонголйтина и инкубируют их в термостате при 37 С в течение 20 ч и определяют площадь зон лизиса, Затем вычисляют разность площади зон лизиса на необлученной пластине и площади зон лизиса на об лученной пластине,Лизис облученной ультрафиолетовыми лучами и необлученной фибриновых пластин стрептокиназной и лонголитином (п=5) представлен в табл., 45Как видно из табл,1, стрептокиназа лизирует лишь фибрин необлученной пластины. Это доказывает, что в облученной пластине плазминоген инактивиП р и м е р 2. В 2 чашках Петри готовят фибриновые пластины аналогичным примеру 1 образом. Пластины выдерживают при комнатной температуре 30 мин для формирования фибрина, Одну из пластин подвергают ультразвуковому облучению с помощью облучателя ртутно-кварцевого настольного ОКНпри 22 С в течение 20 мин под углом 90 к плоскости пластины на расстоянии 40 см от нее, Затем на обе пластины наносят по 0,03 мл раствора стрептокиназы и по 0,03 мл раствора лонголитина, Далее способ выполняют аналогично примеру 1.Результаты определения активаторов плазминогена по предлагаемому и известному способам представлены .в табл,2.Как видно из табл,2, изобретение позволяет повысить точность способатак как в этом случае не занижены показатели фибринолитической активности на пластинах с инактивированнымплазминогеном,Как видно из чертежа,при определении лонголитина на пластинах с инактивированным плазминогеном по предлагаемому способу зоны лизиса имеют ровные края (а), тогда как при определении по известному способу края зон неровные, форма - неправильная(б), что снижает точность определения активаторов.П р и м е р 3, В 8 чашках Петри готовят фибриновые пластины аналогичным примеру 1 образом, Все пластины выдерживают при комнатной температуре 30 мин для формирования фибрина. Затем 4 пластины подвергаюто ультрафиолетовому облучению при 25 Сопод углом 90 к плоскости пластины при следующих режимах: 1 - 5 мин, расстояние 35 см; 2 - 10 мин, расстояние 35 см; 3 - 20 мин, расстояние 40 см," 4 - 30 мин, расстояние 45 см. Затем на все 8 пластин наносят по 0,03 мл раствора стрептокиназы, Да-. лее способ выполняют аналогично примеру 1, Результаты определения активаторов плазминогена (стрептокиназы, 500 МЕ, п=5) представлены в табл,З.Как видно из табл,З, экспозиция менее 1,4 Дк/см не обеспечивает пол 2ную инактивацию плазминогена в пластине, Экспозиция более 2,6 Дж/см вызывает видимые. изменения фибринового1472508 6пластине имеют ровные края и приближаются по форме к окружности, чтообеспечивает высокую точность определения площади зон лизиса. Таблица 1 Активатор 1 Стрептоки-назаЛонголитин 412+20 220+13 0 132+ 5Таблица 2 1 звестный способ Предлагаемый способ Активатор Площадь зон фибринолиза, ммПлощадь зон фибринолиза, мм,актиоблученной необлученной актипрогретой непрогретой пласваторная акватор.ная ак пластиплас" пластины тивность тины ны тины тивность СтепрокиназаЛонголи 412 412 412 ф 20 0 412+20 . 0 220+13 132+5 88 220+13 103+20 117 тин геля. Избранное расстояние 35-45 см от плоскости пластины обусловлено тем, что при уменьшении расстояния менее 35 см происходит заметный разо грев пластины.5Хаким образом, для выполнения способа необходимо облучение ультрафиолетовыми лучами одной из фибриновых пластин до экспозиции 1,4-2,6 Дж/см 101 при этом источник устанавливают на расстоянии 35-45 см.П р и м е р 4. При облучении пластины свойства фибринового геля полностью сохраняются, что подтверж дается следующими данными, 9 мл 0,37. - ного раствора человеческого фибриногена, содержащего плазминоген, на 0,857.-ном растворе хлорида натрия, облучали облучателем ртутно-кварцео вым настольником ОКНпри 20 С во течение 20 мин под углом 90 к плоскости поверхности раствора на расстоянии 35 см от нее, Затем к облучен- ному раствору добавили 0,2 мл раст вора тромбина (400 ед), В течениемин образовывался фибриновых гель. Следовательно, основная функция фибриногена оставалась неизменной, а это говорит о том, что глубоких на рушений структурных единиц фибринового геля. в молек фибриногена не произошло.Способ обеспечивает избирательную инактивацию плазминогена при нор- Зб мальной температуре без грубого изменения фибринового геля, т,е, без частичного обезвоживания и уплотнения. Зто позволяет достичь практически одинаковую плотность фибринового 40 геля на пластине с плазминогеном и на пластине с инактивированным плазминогеном. Зоны лизиса на облученной Формула изобретения Способ определения активаторов плазминогена, предусматривающий приготовление двух фибриновых пластин путем смешивания растворов, содержащих плазминоген человеческого фибриногена и тромбина, инактивацию плазминогена в одной из них, нанесение на пластины исследуемых растворов, инкубацию при оптимальной температуре реакции в течение 16-24 ч, измерение площади зон лизиса фибрина на обеих пластинах и вычисление активности по разности площадей зон лизиса неинактивированной и инактивированной пластин, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, инактивацию плазминогена осуществляют путем облучения ибриновой пластины ультрафиолетом до энергетической экспозиции 1,4- 2,6 Дж/см , причем расстояние междугпластиной и источником облучения устанавливают равным 35-45 см. ЯПлощадь зон лизиса (мм )фибриновых пластин необлученной облученной1472508 Таблица 3 Площадь зон лизиса (мм ) фибринРежимы облучения пластин(время, расстояние, экспозиция) облученноипластины необлученнои пласактиваторная активтины ность 5 мин, расстояние 35 см,0,7 Дж/см10 мин, расстояние 35 см,1,4 Дж/см20 мин, расстояние 40 см,2,1 Дж/см 30 мин, расстояние 45 см,2,6 Дж/см 115 ф 8 2970 412 412 ф 20 412+ 20 412 0 412+20 412 412+20 Составитель Е,Воробьева едактор И.Сегляник Техред Л.Сердюкова Корректор Б,РоманенкоПодписное изобретениям и от Раушская наб., Заказ 1674/28 Тираж 501 ВНИИПИ Государственного комитета 113035, Москва, Жиям при ГКНТ СС