Способ выделения митохондрий из сердечной мышцы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 6 4 СО 3/48 ТЕЛЬСТ е ОСУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ Н ДВТОРСНОМУ СВ(71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ ИЗ СЕРДЕЧНОЙ МЬПИЦЫ(57) Изобретение относится к медицин и биологии, точнее - к способам получения митохондрий, используемых для исследования энергетического состояния клетки в условиях воздействий химических веществ. Цель изобретения - повьппение физиологичности и упрощение способа. Для этого выделяют кусочек мышечной ткани, помещают его в охлажденную до 0-4 С среду й 1 (имидазол 20 мМ; М 8 С 19, 5 мМ; АТР 5,3 мМ; фосфокреатин 15 мМ; КЭГТА 8,1 мМ; КСаЭГТА 1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мГ 1, рН 7,0). В этой. среде ткань расщепляют на отдельные пучки по 1-2 мг, Группу из пяти пучо ков, волокон инкубчруют при 0-4 С в 1 мл среды Р 1, добавляя 40-60 мкг/мл спонина 20 мин при интенсивном перемешивании. Затем препараты, перемешивая, инкубируют в 1 мл среды М" 210 мин также на холоде (состав средыР 2: имизадол 20 мМ; МВС 14 мМ;КН РО3 мМ; К ЭГТА 8, 1 мМ; К Са ЭГТА1,9 мМ; глутамат 5 мМ; малат 2 мМ;димитреитол 0,5 мМ; таурин 20 мМ;2(р-морфолино)этансульфонат калия100 мМ; рН 7,0), Концентрация магнияв обеих средах по 3 мМ, кальция -0,1 мМ. Определяют поглощение кислорода, помещая подготовленные препараты в поляриграфическую ячейку сосредой Р 2 и магнитной мешалкой. Вячейку вводят электрод кларка и регистрируют поглощение кислорода на,оксиметре, через каждые 3-4 мин добавляя субстраты (2 мМ малата, 4 мМглутамата), 60 мМ АДФ, 20 мМ креатина, 1 мМ АДФ, 20 мМ креагина, 1 мМАДФ, 20 мМ креамина, 1 мМ АДФ, 50 мМкарбоксиатрактилозида (КАТ), 20 мМротенона, 10 мкг/мл антимицина, 1 мМазида натрия. Анализируют скоростьпоглощения кислорода, относятих ксырому весу волокон и к общемусодержанию белка в препарате и выбирают оптимальный режим обработкиткани. 2 табл.Изобретение относится к медициней биологии, а именно к способам полуАЧения митохондрий, используемых дляисследования энергетического состоя 5ния клетки в условиях воздействийхимических веществ.Цель изобретения - повышение физиологичности и упрощение способа,Способ осуществляется следующимобразом.Выделяют кусочек мышечной ткани,опомещают его в охлажденную до 0-4 Ссреду 1. В этой среде ткань расщепляют пинцетами на отдельные пучки веом 1-2 мг. Группу из 5 пучков волокон инкубируют при 0-4 С в 1 мл средыс добавлением 40-60 мкг/мл сапонинав течение 20 мин при интенсивном перемешивании, Затем препараты инкубируют в 1 мл среды 2 с перемешиваниемв течение 1 мин, также на холоде.Состав среды 1 - имидазол 20 мМ,МдС 1 9,5 мМ, АТР 5,3 мМ, фосфокреатин 15 мМ, КЭГТА 8,1 мМ, КСаЭГТА 251,9 мМ, глутамат 5 мМ, малат 2 мМ,рй 7,0.Концентрации: магния 3 мМ, кальцияО,1 мМ, Состав среды 2 - имидазол20 мМ, М 8 С 1 4 мМ, КНРО,у 3 мМ, КЭГТА 308, 1 мИ, КСаЭГТА 1;9 мМ, глутамат5 мМ, иалат 2 мМ, дитиотреитол 0,5 мМ;таурин 20 мИ 2(р-морфолино)этансульфонат калия 100 мМ, рН 7,0, Концентрации: магния 3 мМ, кальция О, 1 мМ.Определение поглощения кислорода.Подготовленные таким образом препараты (3-7 мг) помещали в полярографическую термостатированную ячейку,снабженную магнитной мешалкой и заполненную 1-3 мл среды 2. В ячейку40вводили электрод Кларка и поглощениеКислорода регистрировали на оксиметре фирмы Уе 11 оч Бргхпд 1 пвйгщпепйв(ПВА) с самописцем Ьхпеаг. Чувствительность прибора - 230 мг-атом/млкислорода на полную шкалу прибора,скорость движения бумаги 1 см/мин,После помещения в ячейку препаратаскинированных волокон и введениякислородчувствительного электрода 50последовательно через 3-4 мин к нимдобавляют субстраты (2 мМ малата,4 мМ глутамата), 60 мкМ АДФ, 20 мМкреатина, 1 мМ АДФ, 50 мкМ карбоксиатрактилозида (КАТ), 20 мкМ ротенона, 5510 мкг/мл антимицина, 1 мМ азида натрия. Параллельно анализируютскоростипоглощения кислорода, Эти скорости рассчитывают по формуле Ч = А В/С,где А - растворимость кислорода,нг-атом/мл В - скорость движенияпера самописца, см/мин; С - ширинашкалы самописца, см. Полученные скорости относят к сырому весу волокон,а также к общему содержанию белка впрепарате, измеренному методом Лоури.Данные измерений позволили выбратьоптимальный режим обработки ткани(20 ф 5 мин, концентрация сапонина40-60 мкг/мл),В табл. 1 приведена зависимостьвлияния времени обработки и концентрации сапонина на полноту скинирования и дыхательный контроль.П р и м е р 1, При добавлении воксиграфическую ячейку 6,1 мг скинированных волокон (0,75 мг общего белка) скорость поглощения кислорода безсубстратов - 0; после последовательных добавок 2 мМ малата и 4 мМ глутамата - 1,387 нг-атом О/мин мг сыроговеса или 11,75 нг-атом 0/мин мгбелка; 60 мкМ АДФ - соответственно1,988 и 16,84; 20 мМ креатина - 2,59и 219; 1 мМ ЯДФ - 6,01 и 50,92;50 мкМ КАТ - 2,03 к 17,2; прп заменеКАТ на ротенон - 0,42 и 3,55; при замене КАТ на антимицин - 0,29 и 2,45;при замене КАТ на азид натрия - 0,32и 2,71. Таким образом, проводитсяоценка функционального состояния митохондрий в составе скинированныхволокон сердечной ткани, в том числеработа системы окислительного фосфорилирования, цепи переноса электротнов, креатинкиназной системы, транспорта метаболитов, а также интактность митохондриальной мембраны.Всего исследовано 10 проб, дыхательные характеристики скинированныхволокон из сердца крысы представленыв табл, 2 (стандартная ошибка способа7-8 Я). Отсутствие дыхания без митохондриальньр субстратов малата иглутамата, а также полное подавлениедыхания в присутствии ингибиторовцепи переноса электронов (таких какротенон, антимицин, азид натрия) показывает, что поглощение кислородаобусловлено только Функционированиеммитохондрий. Высокая скорость АДФи креатинстимулируемого дыхания(152 нг-атом/мин для АТФ-стимулируемого дыхания в пересчете на мг митохондриального белка) близка в тех жеусловиях к скорости дыхания наиболее1386907 интактной фракции изолированных китохондрий (160-165 нг-атом/мин на мг), что свидетельствует о нормальной работе митохондрий в составе скиниро 5 ванных волокон мышечной ткани. Данные электронной микроскопии и высокая степень ингибирования КАТ, равная 70 Х (табл. 2), показывают наличие интактной митохондриальной мембраны. Таким образом, митохондрии в составе скинированных волокон по их отношению к митохондриальным субстратам, ингибиторам, а также по их морфологии являются интактными митохондриями. Кроме того, измерение содержания в скинированных волокнах цитохрома аа, равного 20,6 ф 1,8 нмоль/г сырого веса, показало, что в полученных волокнах сохраняется вся популяция митохондрий (содержание цитохрома в ,ткани 21,0+1,5 нмоль/г). 25Способ выделения митохондрий изсердечной мышцы, включающий разрушение сарколеммы н ионной среде, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения физиологичности иупрощения способа за счет сокращениястадий процесса, разрушение проводятобработкой сапонином в концентрации(время 20 мин),мкг/мл ЯЭФ/ о 2,60 2,98 2,88 3,05 2,50 1,86 Уменьшение содержания лактатдегидрогеназы (ЛДГ)отражает степень снятия клеточной мембраны. Известно, что дыхательные параметры митохондрий, выделенных иэ мышечной или сердечной ткани, существенно ухудшаются при различных видах патологии, Было оценено изМенение параметров дыхания скинированных волокон сердца крысы при тотальной ишемии 15 и 30 мин при 37 С (без реперфузии) и при катехоламиновой перегрузке, вызванной введением 80 мг/кг веса иэопреналина,П р и м е р 2. При добавлении воксиграфическую ячейку 4,1 мг скинированных волокон сердца, подвергнутого 30 мин ишемии, скорость поглощениякислорода после последовательных добавок 4 мМ глутамата и 2 мМ малата -1,38 нг-атом О /мин на мг сырого весаили 13,43 нг-атом 0/мин на мг белка;60 мкМ АДФ соответственно - 1,65 и16,11; 20 мМ креатина - 1,79 и 17,46;1 мМ АДФ - 3,14 и 30,9; 40 мкМ КАТ -1,81 и 17,7,Как видно из примеров 1 и 2 результаты измерения дыхательных характеристик скинированных волокон указывают на нарушения в функционированиимитохондрий сердца .при патологии и,следовательно, на нарушение энергоснабжения сердечной клети, что даетвозможность применения указанногометода в диагностических целях,Ф о р м у л а и э о б р е т е.н и я,3410 1,840,14 241 Т 0,18 3,220,2 6,1350,4 2,ъ Митюшк оставител Редактор В, Данко ехред рректор Л. Пат.Сердюко акаэ 1491 4 Тираж 847 город, ул, Проектна оиэводственно-полиграфическое предприятие ачам 0115,5 М,3 20,4 Т 1,8 2 вен ма аале ВНИИПИ Государств по делам изобре13035, Москва, ЖПодписнонного комитета СССРний и открытийРаушская наб д. 4/