Способ получения реактива для количественного определения глюкозы

13337Изобретение относится к аналитической биохимии, а именно к способам измерения, использующим Ферменты, и может быть использовано для опреде"5 ления содержания глюкозы в автоанализаторау, применяемых в микробиологической промышленности и медицинской практике,Цель изобретения - повышение точности определения глюкозы. 10Способ осуществляется путем введения в отдельно приготовленные растворы глюкозооксидазы и каталаэы в ацетатном буфере порознь окислителя - пеоиодной кислоты или ее солей 5 в массовом соотношении фермент - окислитель 1:(0,1-0,7), затем низкомолекулярные примеси отделяют и растворы,каталазы и глюкозооксидазы в соотно 4. шении 1:1 по активности смешивают с 2 д этанолом.Согласно предлагаемому способу в реактив вводят отдельно приготовленные растворы окисленной глюкоэооксидазы и катализы в эквивалентных по 25 активности количествах в отличие от известных способов, где каталаза в реактиве отсутствует или содержится только в виде примесей. При предварительной обработке каталазы и глюко- ЗО зооксидазы периоднойкислотой илиее солями окисляется углеводный компонент ферментов, что стабилизирует сам фермент. При этом Ферментный реактив очищен от низкомолекулярных примесей,. которые проникают через мембрану в анализируемую среду.Эти условия получения реактива обеспечивают продолжительность эксплуатации его без снижения точности 40 измерений содержания глюкозы при непрерывной продолжительной работе авто- анализатора. Способ иллюстрируется примерамы конкретного получения реактива и испытания его в условиях непрерывного автоматического режима.Подбор условий стабилизации ферментов глюкозооксидазыи каталазыпредставлен в табл,1, где в примерах 6-9 пред.ставлены запредельные значения соотношений фермент-окислитель.П р и м е р 1. 400 мг глюкозооксидаэы, соответствующих 100000 единиц активности, растворяют в 40 мл 5 0,05 М ацетатном буферном растворе рН 5,8, добавляют 18,4 мл 0,57.-ного КЗО (92 мг) (соотношение 1:0,25), смесь перемешивают и инкубируют 3 чОпри 4-8 С. Затем прибавляют 0,042 мл.12 2 этиленгликоля, 30 мин перемешивают и диализируют для удаления нйзкомолекулярных примесеи. 40 мг к талазы, нсоответствующих 100000 еди иц активности, растворяют в 4 мл 005 М ацетатном буферном растворе рН 5,8, донанляют 1,84 мл 0,5 Е-наго 5,ЛОа (9,2 мг) при этом соотношени фермент - окислитель равно 1:0,28, сме ь перемешивают и инкубируют 3 ч при -8 С, Затем прибавляют 0,004 мл этиленглико. - . ля, 30 мин перемешивают и диализируют для удаления низкомолекулярных примесей. Растворы глюкозооксид зы и ката- лазы в соотношении по акти ности 1:1 смешивают с этанолом до конечной концентрации этанола 252.П р и м е р 2. 400 мг глюкозооксидазы, соответствующих 101000 единиц активности, растворяют в 5 мл 0,05 М ацетатном буферном раствор рН 5,8, добавляют 8 мл 0,5 Х-ной НЛ 4 2 Н 0 (40 мг) (соотношение Ферме .т - окис-., литель 1:0 1) и далее операции повто 1 ряют по аналогии с примером 1,40 мг каталазы, соответствующих 100000 единиц активности, раствор ют в 5 мл 0,05 М ацетатном буферном растворе рН 5,8, добавляют 0,8 мл 05 Х-ного НЛО 2 Н О (4 мг). Послед пцие операции повторяют по аналогии с примером 1,П р и м е р 3. 400 мг глюкоэооксидазы, соответствующих 1 ОФООО единиц активности, растворяютв 30 мл 0,05 М ацетатном буферном растворе рН 5,8, добавляют 28 мл 12.ного 141 а 304 ЗН О (280 мг), приэтом соотношение фермент-окислитель равно 1:0,7 и далее операции повторяют по аналогии с примером 1.40 мг каталазы, соответствующих 100000 единиц активности, растворяют в 3 мл 0,05 М ацетатном буферном растворе,рН 5,8, добавляют 2,8 мл 1 Е-ного Ма 304 ЗН О (28 мг). Последующие операции повторяют по аналогии с примером 1. При соотношении фермент 5 к окислителю 1:(0,1-0,7) окисляетс 1 около 307. углеводов фермента при ,сохранении 1003-ной активности, Уеньшение соотношения фермент - окислитель менее 1:О,1 (примеры 6 и 7) Не обеспечивает достаточного окисления углеводов и, следовательно 4 необкодимой стабильности. С увеличением количест:0,2 3 :0,25 33 100,0 О,3 13337 ва окислителя более 1:0,7 (пример 8 и 9) процент окисленных углеводов растет,.но при этом уменьшается активность фермента. Экспериментально5 доказано, что дальнейшее увеличение концентрации окислителя не способствует интенсификацииокисления углеводов при одновременной потере каталитической активности фермента.1 ОСравнительные испытания ферментных реактивов, приготовленных по предлагаемому и способу-прототипу, принятому в качестве базового и применяемого на анализаторе "С 1 цсозе Апа 1 ыег" фирмы "Бекман", проводили в автоанализаторе АКГпри измерении концентрации глюкозы в модельном растворе глюкозы 1 г/л с периодичностью 36 мин в течение 20 сут.20Испытания показали, что благодаря использованию предлагаемого реактива значительно увеличивается время непрерывной работы без снижения точности ,показаний (табл.2). 25Измерения содержания глюкозы на 6-й день и далее по базовому реактиву в связи со значительными погрешностями не проводили.Как видно иэ результатов испытаний, З 0 на 2-е сут точность измерений у базового объекта падает на 247, а у предлагаемого сохраняется еще на 17 сут (допустимые потери + 5 Е).Использование реактива, полученного согласно предлагаемому способу,1 г4обеспечивает значительное повышение точности измерения содержания глюкозыпри непрерывйом проведении анализовблагодаря стабилизации реактива, атакже возможность использования автоанализаторов глюкозы для контроля в процессах ферментации, продолжительность которых исчисляется несколькими сутками с соблюдением условий герметизации.Реактив, полученный согласно изобретению, может быть использован в процессе биосинтеэа антибиотиков,Ф Формула изобретения Способ получения реактива для количественного определения глюкозы в растворе, предусматривающий приготовление ферментного раствора глюкоэооксидаэы и каталаэы в ацетатном буфере в заданном соотношении и смешивание с одноатомным спиртом, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности непрерывного определения глюкозы, одновременно готовят растворы глюкозооксидаэы и каталазы в ацетатном буфере, вводят в них периодную кислоту или ее калиевую и натриевую соли в массовых соотношениях фермент - окислитель 1:(0,1-0,7), низкомолекулярные примеси отделяют диализом и полученные растворы, взятые в соотношении :1, по активности смешивают с этанолом.1333712 Продолжение табл.) Каталаза Глюкозооксидаза Пример АктивОкисление угОкисление угивсть,сть заглюкозолеводов, 7. ев окси даза к .окисли 100,0 100,0:1,5 51 родолжение табл. Табли змерение содержания глюкозы,Х мерение содержания глюкозы,Е Дни Базовый реак- Пре агаетив (прототип) реактив Базовый реак- Предлагаемытив (прототип) реактив 100,0 00,0+ О,100,0+ 0,5 8,3,1 0,5 12 00,0 + 0,72 00,0 1 0,83 00,0 1 1,48 бб,б ф 1 4 3,22 2,88 Составитель Л, БорисоваРедактор М. Недолуженко Техред М,Ходанич Корректор С , Шекм Подписное аказ 3926/24ВНИИПИ Государстпо делам изобре113035, Москва 9 Тираж 499 б., д.4/5 венно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4,4" О,б ,8 + 1,3 Соотношениекатапаенного комитета ений и открытий -35, Раушская н 100,3 ф 0,85 100, + 2,24 7,1: 0,085 е 7 К. 3,47