Ферментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эфиров

З СОВЕТСКИХЦИАЛИСТИЧЕСКИХ УБЛИК А 1 114 С С 1 И 27/ ИЗ ИС ТЕНИ ЕЛЬСТ Иф 10арственныиьян ва-ЛеЭ,П. МедяБабкина у цева, Е,Б.сле" хи икольска роды в и - Успех 1 О, с. Элек имия дах,др не 2ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПо ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ТОРСНОМУ СИИ(56) Матерова Е.А.,Ионоселективные элекдовании холинэстеразмни, 1980, т. 69, вь1944.Будников Г,К, ихелатов металлов вМ.: Наука, 1980, с,(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ТИОХОЛИНОВЫХЭФИРОВ(57) Изобретение относится к аналитческой химии и может быть использовано для определения субстратовхолинэстераз. С целью повышения чувствительности и селективности определения токосьемник выполняют иэамальгамированного серебра. Мембрана выполнена из нитрата целлюлозы,в которую введена холинэстераза и .глутаровый альдегид в количестве10,6-12,6 и 17,5-18,0 мас. соответственно, Это позволяет определятсубстрат в количестве 110 м/л вприсутствии тиохолиновых эфиров.1 ил.,2 табл.Изобретение относится к электро- химическим устройствам, используемым в аналитической химии для опре-, деления соответствующих субстратов, ингибиторов, активаторов холинэстераз, а также может быть использовано в энзимологии для определения скоростей ферментативных реакций.Цель изобретения - увеличение чувствительности и селективности определений.Отклик ферментного электрода на концентрацию субстратов холинэстераз наблюдается практически мгно 4 венно.Определение субстратов и ингибиторов ХЭ основано на электрохимичес кой активности одного из продуктов гидролиза субстрата, специфичного к ХЭ - бутирилтиохолин иодида БТХИ), С НСОБСН - СН- ВСН)з 3 + НО- -СНСООН + НБСН- (СН)з 3Продукт гидролиза БТХИ - тиол способен образовывать меркаптид ртути,25который восстанавливается на ртутномкапельном и амальгамированном серебряном электродах.На вольтамперограммах БТХИ настационарном амальгамированном серебряном электроде наблюдается небольшой,пик при потенциале -0,55 В относительно насыщенного каломельногоэлектрода, который быстро растет вприсутствии ХЭ, Высота пика зависитот концентрации как субстрата и ингибиторов ХЭ, так и ее активности иконцентраций, ферментный электроди электрод сравнения погружают ванализируемый раствор, содержащий 40буферный боратный раствор с рН 8,28 4, Раствор термостатируют при 25оили 37 С, продувают током водородаили аргона и снимают вольтамперограммы в интервале потенциалов 45(-О, 1)-(-0,8) В, Минимальный объеманализируемого раствора 4-5 мл,На чертеже изображен предлагаемый электрод.Электрод состоит из стеклянного 50или фторопластового корпуса амальгамированного серебряного электрода1, в который вставлена серебряная .проволока 2, спаянная с медной 3гофрированной пленки 4 из нитратацеллюлозы с включенной в нее ХЭ иприжимных колец 5,Серебряную проволоку диаметром0,5 мм закрепляют и стеклянной трубке или фторопластовом стержне с помощью эпоксидной смолы ЭПД или механически. Затем поверхность электрода шлифуют до зеркального блеска иопускают в металлическую ртуть на2 мин и излишки ртути стряхивают.Для получения иммобилизованнойХЭ 0,1 г нитрата целлюлозы растворяют в смеси органических растворителей толуола и бутилацетата 1:1,6),добавляют 02 мл водного раствора ХЭ(навеска 0,0180 г) и после перемешивания - гексан в качестве коагулянта. Для более прочного связыванияфермента с матрицей перед добавлением гексана приливают 0,1 мл 25%-ногораствора глутарового альдегида. Изэтой смеси на стеклянной поверхностиполучают пленку, из которой выре"зают кусочки размером 25 б 5 мм, Пленку закрепляют на поверхности корпусаэлектрода с помощью прижимных колецили других зажимов, для увеличениярабочей поверхности пленку используют в гофрированном виде,Определения с предлагаемым фер -ментным электродом осуществляют следующим образом,П р и и е р 1, Построение градуировочного графика для определенияБТХИ.В мерную колбу на 5 мл вводят0,05-3,00 мл стандартного раствораБТХИ с концентрациеи 0,005 г/мл,доводят до метки боратным буфернымраствором с рН 8,4, Переносят раствор в электролитическую ячейку снасыщенным каломельным электродом иферментным электродом, удаляют кислород продуванием в течение 15 мин(время достижения равновесия реакции гидролиза должно быть постоянным во всех определениях) аргономили электролитически генерированнымводородом, Снимают вольтамперограммы в интервале потенциалов от -0,1до 0,8 В при скорости наложения потенциала 1 В/с при непрерывном режиме поляризации с треугольной разверткой потенциала, Измеряют высоту пика при потенциале -0,55 В,Строят градуировочную прямую, выражающую зависимость величины тока впике от концентрации БТХИ,Определение неизвестной концентрации субстрата,В мерную колбу на 5 мл вносят н известное количество БТХИ, доводятз 1296913 до метки боратным буфером с рН 8,4, перемешивают и переносят ячейку. Все дальнейшие операции проводят Введено как описано выше, По высоте пика С,104 при потенциале -0,55 В и градуировоч./ ному графику определяют концентрацию субстрата.В табл. 1 приведены результаты 0,30 определения БТХИ с помощью предлагаемого ферментного электрода (и = 4; 30 0,60 Р = 0 95).Таблица 1 1,00ВведеноФ НайденоС10г/мл ьтхиг/мл, Х Вт 10а 0,85 1,0 7,6 20 3,5 3,45 1,6 10,10 10,0 1 ь 5 25П р и м е р 2. Определение концентрации ингибитора (хлорофоса),В медную колбу на 5 мл вводят 1 мл стандартного раствора БТХИ концентрацией 0,005 г/мл, добавляют от 0,05 до 0,20 мл стандартного раствора хлорофоса с концентрацией 0,005 г/мл, доводят боратным буферным раствором до метки, перемешивают и переносят в электролитическую ячейку с насыщенным каломельным и ферментным электродами, Удаляют кис лород в течение 15 мин током аргона или водорода и снимают вольтамперограммы в интервале потенциалов40 (-0,1)-(-0,8) В (скорость наложения потенциала 1 В/с, непрерывный режим поляризации, треугольная развертка потенциала), Измеряют высоту катодного пика при потенциале -0,55 В.Строят градуировочную прямую, выражающую зависимость высоты катодногопика от концентрации ингибитора,Неизвестную концентрацию ингибитора находят по градуировочному графику.В табл, 2 приведены некоторые результаты определения хлорофоса спомощью предлагаемого ферментногоэлектрода (н = 4; Р= 0,95). Предлагаемый ферментный электродпозволяет снизить нижнюю границуопределяемых содержаний субстратапо сравнению с известными способами определений до 1 10 моль/л,повысить селективность определений(дает отклик в присутствии лишьтиохолиновых эфиров). С помощью предлагаемого электрода можно определятьне только субстраты, но и ингибиторы холинэстераз до концентрации110 И (0,210 г/мл). Электродпрост в изготовлении, его конструкция позволяет легко заменить фермент, потерявший активность на новый.путем замены пленки, содержащей иммо.бил.зованную ХЭ,Время жизни мембраны составляет1 неделю.формула изобретенияФерментный электрод для определения концентрации тиохолиновых эфиров, включающий корпус, внутри которого расположен токосъемник, электролитически связанный с мембраной, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и селективности определения, в качестве токосъемника использован серебряный амальгамированный электрод, а мембрана выполнена из пленки на основе нитрата целлюлозы с введенными в нее холинэстеразой и глутаровым альдегидом в следующих количествах, мас, 7.:Холинэстераза 10,6"12,6 Глутаровый альдегид 17,5-18,0Нитрат целлюлозы . Остальное1296913Составитель И. РогальРедактор Н, Киштулинец Техред И.Попович Корректор Г. Решетник Заказ 769/45 Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР.по делам изобретений н открытий113035, Москва, Ж, Раушская набд. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4