Способ получения антибиотика 76

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 7 НИЯ ИЗОБР ПИ НТУ н Кемик оЙВ.оЬ .1974 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(72) Киоси Исоно, Гото Наки Сит ео Фудзита ( 1 Р)(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА 76-11, предусматривающий культивирование штамма Асгдпошаоига Бр76-11 ГЕВМ ВР 83 при аэрации на водной питательной среде, содержащей37 овсяной муки, 1,57 глицерина и0,57 мясного экстракта, удаление выращенных клеток, выделение антибиотика из культуральной жидкости этилацетатом с последующей очисткой его методом хроматографии на силикагелес элюцией антибиотика смесью, состоящей из 507. бенэола и 507 этилацетата.20 50 Физиологические характеристики.Штамм хорошо растет при 33-37 С, 55слегка разжижает желатин, свертываети пептонизирует снятое молоко и необразует меланинового пигмента,Изобретение относится к способам понучения антибиотиков.Целью изобретения является способ создания высокоэффективного антикокцидиоидозного препарата. 5Используемый микроорганизм принадлежит к роду Асй 1 пошадцга, штамм Бр. 76-11 и способен продуцировать антибиотик 76- 11. Штамм Бр 76- 11 хранится в Институте ферментационньи исследований Ведомства по промышленной науке и технике Министерства международной торговли и промышленности (РЕКМ). Штамму присвоен номер РЕКМ ВР. 15Характеристики штамма Бр 76-11 на различных культуральных средах наблюдают через 20-30 дней после инокуляции:о-Арабиноза. хороший рост0-КсилозаП-ГлюкозаП-ФруктозаСахароза1-Инозит рост есть25М,-Рамноза хороший ростРафиноза рост естьЫаннит очень хорошийростШтамм Бр 76-11 может быть охарак теризован следующими признаками.Морфологические признаки.Бр 76-11, как правило, не образует воздушный мицелий, но иногда образует его по прошествии длительного перно да культивации. Субстратный мицелий является изогнутым, и в последний период культивации делится с образованием эллиптических спор. Мицелий грамположительный и кислотостойкий. 40Рост на различных средах.Бр 76 - 11 не растет или плохо растет на различных агарах, но агар с овсяной мукой и агар с дрожжевым экстрактом и солодовым экстрактом яв ляются для него хорошей культуральной средой.Штамм лучше растет на агаре с овсяной мукой и образует голубоватоиндигоидный, нерастворимый в воде пигмент в клетках по прошествии 3 недель культивации. Использование сахаров.Штамм хорошо использует о(,-арабинозу, В-ксилозу, П-глюкозу, Л-фруктозу, сахарозу, 1-инозит,с 6 -рамнозу.рафинозу и маннит на агаре Придхэмаи Готлиба в качестве культуральнойсреды, к которому добавлено 0,17.дрожжевого экстракта.После проведения культивированияна жидкой среде культуральный бульон центрифугируют для отделения клеток от бульона. Полученный таким путем антибиотик 76-11 может быть выделен из культуральной среды любымобщепринятым методом, который обычноиспользуется для выделения метаболита. Например, можно применить метод,использующий различие в растворимости между антибиотиком 76-11 и примесью, или метод, использующий адсорбционное сродство между ними, илиих комбинации,Выработанный антибиотик 76-1 присутствует как в культуральном бульоне, фтак и в клетках, и может бытьэкстрагирован из культурального бульона с использованием этил- или бутилацетатов, хлороформа, бутанолаи т.п., в зависимости от их растворимости. Клетки экстрагируют воднымацетоном или водным метанолом, органический растворитель отгоняют припониженном давлении, и полученныйтаким путем водный раствор экстрагируют этилацетатом и т.п. Экстрагированные растворы комбинируют и кон-центрируют с получением сырого экстракта антибиотика 76-11, Посколькусырой экстракт содержит большое количество примесей, его подвергают адсорбционной хроматографии с использованием силикагеля, окиси алюминияи т.п., а затем очищают. Например,3сырой экстракт, растворенный в небольшом количестве бензола, вводятв колонку с силикагелем, предварительно кондиционированную бензолом.Элюирование проводят с использованием бензола, а затем смесью растворителей бензол - этилацетат, в которой содержание этилацетата постепенно возрастает. Элюат фракционируют с применением коллектора фракций.Собирают Фракции, проявляющие биологическую активность, и концентрируютих с получением очищенного порошка.Для дальнейшей очистки повторяют аналогичную процедуру хроматографии наз 1276силикагеле. Последующую очистку проводят с применением преперативнойтонкослойной хроматографии, если этонеобходимо. Концентрирование при пониженном давлении дает очищенныйпродукт, который затем растворяют внебольшом количестве метанола и охлаждают, причем антибиотик 76-11 вьтделяется в виде бесцветных кристаллов.Кристаллы отделяют фильтрованием и тОсушат с получением чистого антибиоти-.ка 76-И.Полученный таким путем антибиотик76-11 характеризуется следующими физико-химическими и биологическими 15свойствами.Элементный анализ.Свободная кислота, 7: С 62,61;Н 8,27; Ы О.Натриевая соль, 7: С 60,57; 20248 Подопытныемикроорганизмы Минимальная концентрация для подавления роста,мкг/мп БсарЬУ 1 ососсцвацгецв 209 Р 0,4 БарЬУ 1 ососсцвацгецв (тптт 1 дгевдв 1 ап 1) 0,4 Васд 11 цв яцЬ- ед 1 дв РС 1219 0,4 Васд 11 цв яцЬсд 1 дв Н 17 0,4 Васд 11 цв вцЬсд 1 дв ш 45 (тес-) 0,4 0,4 0,4 МусоЬас сег дцшБр 607 МусоЬассегдцшрЬ 1 ед 0,4 МусоЬасТегдцтп ачдцтп ЕясЬегдсЬда со 1 д 100 Ба 1 шопе 11 агурЬдшцгдцтп 100 Действие на опухолевые клетки.Антибиотик 76- 11 проявляет индукцию дифференцирования в отношении клеток лейкемии Френда и клеток миелоидной лейкемии в концентрации 1- 100 мкм/мл.Токсичность для мышей.Абдоминальное введение 50, 100 и 200 мг/кг антибиотика 76-11 в виде КМЦ-суспензии показало отсутствие токсичности для мьшей. Цвет; бесцветные кристаллы.Антимикробная активность в виде минимальной концентрации для подавления роста различных микроорганизмов на бульоно-агаровой культуральной среде приведена в таблице.1276 В 161 И 1 П 1 Заказ 6585/59 Тираж 490 Подписное пр-тие, г. Ужгород, уп. Проектная, 4 Произв.-полигр. 511 ри сравнении Физико-химических и бцо,огцессих свойств антибиотика 6 - 11 со с.войствами известных антибиотиков, ацтибиотик 76-11 может быгь классифицирован как так называемый поли. эфир-.иоцофорцый антибиотик на том основании, что оц является кислым веществом, его натриевая соль растворима в масле, оц проявляет сильную активность в отношении грам положительных и кислотоустойчивых бактерий, не содержит в своей молекулярной структуре а.зота и т.п. Известные вещества не проявляют таких физико-химических свойств, особенно специфических полос УФ-спектра поглощения, как антибиотик 76-11, поэтому последний является новым антибиотиком.А.тибиотик 76-11 получают следую) щим образом.11 ирооргацсз Нр 76-11 (РЕБМВР-ЯЗ), предварительно культивированный в скошенной культуре, инокулируют в жидкую культуральную среду, содер жащую Зовсяной муки, 1,5% глицерина. и 0,5/ мясного экстракта (рН около 6,5), и культивируют при 28 С в течение 11 суток при встряхивании.Каждые 3 мл культурального раствора ц инокулируют в свежую культуральную среду, содержащую те же составляющие, и культивируют еще в течение 7 суток.140 мл кульгуральцого раствора, полученного таким путем, инокулируют в 18 л культуральной среды, содержащей те же составляющие в баковом фермецтаторе, и культивируют при 28 С в течение 210 ч с аэрацией 18 л/мин и перемедиванем со скоростью 40 330 обмиц.После гсультгсвацги в куэ.туральнЙ раствор добавляют 400 г диатомита (Радиолит 700), после чего раствор подэергсгю центробежной фильтрации. Полученную надосадочную жидкость (4 л рН 7,8) дэажды экстрагируют 8 и 5 л этилацетата с.оответственно, а клетки экстрагируют дважды соответственно 9 и 6 л ацетона. Экстрагированный раствор концентрируют в вакууме с получением 2 л водного раствора (рН 8), ксторый затем дважды экстра 248 Ьгируют в 1 л э сцэацетатг. 11 оследццй проэкстрагироваццый этилацетатом раствор смепинают с первым раствором, пслучецным из надосадочной жидкости, и концентрируют в вакууме. Полученный таким путем осадок растворяют вцебольшом количестве бензола, который вводят в колонку с силикагелем(ф 3 х 50 см), предварительно конди -ционированную бензолом. Элюированиепроводят с использованием 2 л бензола, а затем 1 л смеси бензол-этилацетат (5: 1 по объему), 1 л смеси бензол-этилацетат (1: 1 по объему). Активные Фракции элюируют смесью бензол-этилацетат (1:1 по объему), собирают, концентрируют в вакууме и обрабатывают метанолом с получением 1 г сырого кристаллического вещества, Несколько перекристаллизацпй из метанола дают 400 мг чистого кристаллического вещества натриевой соли антибиотика 76-11.Далее антибиотик испытывают в качестве ацтикокцидиоидозцого препарата.Устацовлецо, что цыплята, которым вводят антибиотик 76- 11, не проявляют каких-либо симптомов кокгидиоидоза даже после инфицирования, т.е, рост ооцист Еппегга сете 1.а существенно подавляется, следовательно, антибиотик 76- 11 исключительно эффективен как антикокцидиоидозцый препарат.Введение антибиотика 76-11 в кон центрации 25 и 50 млн , ускоряет рост на 6,1 и 7, 1% соответственно, и повышает эффективность усвоения кормов на 5,9 и 7,4% соответствецпо.Введение антибиотика 76-11, полученного согласно предлагаемому способу, травоядным животным ускоряет их рост и повышает эффективность усвоения ими кормов. Кроме того, введение антибиотика 76-11 не только предотврацает раздувание живота или кетоз, часто наблюдаошееся у крупного рогатого скота, которому скармливают большие количества концентрированных кормов, цо и излечивает животных, которые уже страдают от подобньгх за - болеваций.