Способ получения биомассы менингококка

, 1159948 19) 8 6 00 С 12 4(5) С 12 ЯЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ЭОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЪЮ ГОСУДАРС ПОДЕЛАМ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Н АВТОРСКОМУ Боровкова,ахина,И.Я. Ива следовасыворото опольский нститут ства сыво" гококковой итирующе БИОМАССЪ овленияпутем ьную среду(46) 07.06.85. Бюл. Ф 21 (72) И.А. Баснакьян, В.И.Т.А. Артемьева, Н.Н. АлексА.А, Демина, Ю.В Филипповшиашвили, И.А.-А. Коркмасо и В.В. Ерещенко (71) Центральный научно"ис тельский институт вакцин и им. И.И. Иечникова и Ставр научно-исследовательский и вакцин и сывороток (53) 5768.093.1(088.8) (56) 1. Регламент произврд ротки диагностической менингруппоспецифической прецип сухой, У 11.1-78,(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕНИНГОКОККА для приго диагностических препарат посева инокулята в питат выращивания в условиях аэрации и kеремешивания с последующим выделением целевого продукта, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфической активности диагностических препаратов, в качестве инокулята используют суспензию менингококка, образующего колонии в б-форме, перемешивание осуществляют со скоростью 50-100,об/мин в начале процесса с постепенным увеличением числа оборотов мешалки до 250-300 в минуту, а аэрацию проводят путем подачи воздуха со скоростью 10- 20 л/мин в начале процесса с увеличением ее до 100-150 л/мин в конце процесса, при этом концентрацию растворенного в среде кислорода поддержи- . вают на уровне 10-203 от полного насыщения, и выделяют целевой продукт на стадии снижения удельной скорости роста от максимальных до 2/3 максимальных значений.аМ1159 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касаетсяполучения биомассы менингококков,используемой для приготовления диагностических препаратов. 5Известен способ получения биомас"сы менингококка для приготовлениядиагностических препаратов путем посева инокулята в питательную среду,выращивания в условиях аэрации и 1 Оперемешивания с последующим вьщелением целевого продуктаОднако известный способ не обеспечивжт высокой специфической активности диагностических препаратов. 5Целью изобретения является повышение специфической активности диагностических препаратов.Эта цель достигается тем, чтосогласно способу получения биомассы 20менингококка для приготовления диагностических препаратов путем посеваинокулята в питательную среду, выращивания в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением 25целевого продукта, в качестве инокулята используют суспензию менингококка, образующего колонии в К-форме,перемешивание осуществляют со ско"ростью 50-100 об/мин в начале процес.ЗОса с постепенным увеличением числаоборотов мешалки до 250"300 в минуту, а аэрацию проводят путем подачивоздуха со скоростью 10"20 л/рин вначале процесса с увеличением ее до100-150 л/мин в конце процесса, приэтом концентрацию растворенного всреде кислорода поддерживают науровне 1.0-207 от полного насыщения,и вьщеляют целевой продукт на стадии снижения удельной скорости ростаот максимальных до 2/3 максимальныхзначений,П р и м е р 1. Штамм Иеьввег 2 а1 шеппрьсЫдв Вс 5 хранят в высушенном 45состоянии в ампулах, культуру для ,которых готовят из одной колонии,находящейся в Ь-форме. Культуру изампулы засевают в чашки Петри на1,57-ный агар Хоттингера с добавлекием 207 сыворотки крупного рогатогоскота и выращивают при 37 ОС в термостате в течение 18 ч в атмосфереВыросшую культуру (1-2 чашки) 55смывают физиологическим растворомпри рН 7,0 и делают второй пассажна чашки. Смыв культуры из второго 948 2 пассажа засевают в ферментер с жидкой питательной средой, в которой в качестве источника азота взят казеиновый гидролизат с содержанием азота 150-160 мг 7., в качестве источника углерода - крахмал растворимый, в качестве минеральных соЛей КН РО ,2 4 ф МоС 1 , СцЯС , хдориды, в качестве стимуляторов роста - цистеин, глютаминовую кислоту и диализат дрожжейпри следующем соотношении компонентов: каэеиновый гидролиэат из расчета в готовом продукте 150-1 бО мг 7. аминного азота, минеральные соли, г: КНХРО 4 059 МКС 1 04 Сцзо+ 0001259 цистеин .0,03; диализат дрожжей 100 мл; глютаминовая кислота 0,75 г; хлориды 0,8 г; крахмал растворимый.1,0 г; дистиллированная вода до 1,0 л.Инокулят вносят из расчета О,1- 1,4 млрд клеток на 1 мл питательной 1 среды, Выращивание в ферментере осуществляют при постоянном увеличении числа оборотов мешалки от 50 вминуту в начале процесса до 250 в мину-. ту в конце и подачи воздуха от 10 л в минуту в начале процесса до 100 л в минуту в конце, при этом концентреция растворенного в среде кислорода поддерживается на уровне не ниже 107 от полного насыщения. Собирают целевой продукт - биомассу на стадии, нри которой удельная скорость роста равна максимальной для данной среды величине, равной 1,0 ч . Биомассу собирают вместе с культуральной жид-. костью в тот период, когда оптическая плотность популяции достигает 2 ед.ЕС,Фиксацию культуры для получения группоспецифических сывороток осуществляют путем однократного замора" живания и последующего. длительногохранения живой культуры нужной Фазыразвития при -.20 С; Фиксацию:культуры для реакции агглютинации настекле осуществляют путем,лиофильного высушивания; фиксацию культуры дляреакции преципитации в агаре и встречного злектрофореза осуществляют путемдействия мертиолята, сбора клеток центрифугированием, разрушения поверхностных слоев клеточной стенки щелочными значениями рй и высушиваиия трехкратной обработкой ацетоном; Фиксацию культуры для приготовленияэритроцитарных антигенных диагностикумов, осуществляют путем действияс гомологич пы Вс 5В чной серогруп х группы гетерологи пы А серогруппь С3 1159 мертиолята, сбора клеток центрифугированием, разрушения полученной влажной массы ультразвуком, выделения растворимых антигенов-сенситинов.П р и и е р 2. Посев культуры из ампулы на чашки с сывороточным ага- ром, а затем пересев культуры второго пассажа с чашек в фериентер с жидкой питательной средой осуществляется по примеру 1. Состав жидкой среды, г: 4 ОКазаминовые кислоты 10,0Ва НРО, 10,0КС 1 0,09 .Мо 8 ЯО 7 Н О . 0 06Глюкоза 5,0рИ 7,4Выращивайие в ферментере осуществляютри постепенном увеличении оборотов мешалки от 100 .в минуту в начале процесса до 300 в минуту в конце о и при подаче воздуха от 20 л в минуту в начале процесса до 150 л в кон" це. При этом концентрация растворенного в среде кислорода .поддерживается на уровне 20% от полного насыщения.Собирают целевой продукт - биомассу на стадии, при которой удельная скорость роста равна величине, составляющей 2/3 максимальной, т.е.0,66 ч . Биомассу собирают вместе с культуральной жидкостью.30фиксацию культуры осуществляют по примеру 1.,Способ позволяет накопить биомассу, которая может быть использована для. получения диагностических сыво- И роток и других диагностических препаратовПосле иммунизации кроликов этой биомассой по общепринятой схеме получены менингококковые сыворот 40" 948 4ки, отличающиеся высокой групповой специфичностью, стандартностью, активностью. Данные приведены в табл.и 2. / О возможности использовать биомаси су, полученную предлагаемым способом, в качестве антигена в реакции микропреципитации в агаре свидетельствуют следующие результаты. После сбора биомассы, центрифугирования и доведения до 50 ед. мутности ее подвергают действию раствора мертиолата 1:10000 и щелочных значении рН 9,0-9,2 в течение часа. Результаты микропреципитации этой биомассы с соответствующими сыворотками представлены в табл,3.Использование способа позволяет получать биомассу менингококка серогруппы Вобладающую высокой групповой специфичностью, сыворотки, полученные против этой биомассы, помимо высокой групповой специфичности, обладают высокой чувствительностью, что улучшает диагностику.Для сенсибилизации эритроцитов с целью получения ультразвукового эритроцитарного диагностикума, дающего одной силы реакцию, требует-ся в 200 раз меньшее количество биомассы, полученной предлагаемый способом, Кроме того, разработанная технология приготовления диагностических сывороток, включающая фиксацию биомассы замораживанием, позволяет в 30-40 раз сократить время, идущее иа выращивание культуры и стабилизовать свойства биомассы и нолучаемых из нее .сывороток.Т а б л и ц а 11159948 Таблица 2 Таблица 3 Титры антител Способ по- В сывороткилучения РаэведеКоличествополос ние антигена Известный 1: 160 10 1 1:8 Нераэведенная 1: 160 1 ф 16 Нераэведенная Предлагаемый 151:4096 4910 1:2 4910 1 ф 324911 1 ф 4 4911 1:4 3 4914 29 4913 1: 16 1:4 4914 1:8 4915 1;4 1 ф 1024 4916 1116 1:2 1: 4096 4917 1:32 1:4 1:4096 4918 1: 16 4918 1:2 1:4096 4919 1:4 Эр 4919 1: 32 Составитель Г, СмирноваРедактор Т. Кугрышева Техред З,Палий Корректор А. Тяско Заказ 3693/23 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г, ужгород, ул. Проектная, 4 1:10 1:80 1 ф 2561;10241: 128В сиво"3 ротки4916фЯ4917 Разведениесиворотки