Способ обнаружения протонного обмена в гетерогенных системах

(72) А.С,Еварестов и А.В.Анисимов (7.1) Казанский институт биологии Казанского Филиала АН СССР (53) 539, 143.43(088,8)(56) 1. Сагг Н.У., Рцгсе 11 Е.М. Н 18 Ь Кеяо 1 цгдоп %ЧН Брессгоясору. РЬуя. Реч., ч. 94, 1954, р. 630.2. Соп 1 оп Т ОцгЬгей Й. Арр 11 а 11- опя оГ Ицс 1 еаг Ма 8 пег 1 с .Неяопапсе Бресггоясору, ВВА, ч. 288, 1972, 354 прототип).(54)(57) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОТОННОГО ОБМЕНА В ГЕТЕРОГЕННЪХ СИСТЕМАХ, включающий внедрение в образец, содержащий области, ограниченные мембранами, парамагнитных ионов и воз 780 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРИТИ действие на образец серии 90-180- 180радиочастотных импульсов,оо т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью однозначного обнаружения протонной проницаемости мембран и увеличения точности измерений, иссле" дуемый образец дополнительно подвергают воздействию двух 180-градусных импульсов, разделенных интерваломкоторые включаются перед серией импульсов, причем интервал между моментом включения второго дополнительного импульса и серией импульсов определяют по отсутствию сигнала свободной индукции после пробного 90-граО дусного импульса и по наличию изме- Е нения крутизны спада поперечной намагниченности от интервала 1 1 обнаруживают обмен.Изобретение относится к областиЯМР-спектроскопии, занимающейся исследованием протонного обмена в гетерогенных мембранных системах, и может быть использовано для обнаружения протонного обмена при оценкепроницаемости мембран методом парамагнитного допинга,Известен способ измерения обменас использованием импульсного методаЯМР 11.Недостатком данного способа является неоднозначность доказательствапротонной проницаемости мембран,Наиболее близким к изобретениютехническим решением является способобнаружения протонного обмена в гетерогенных системах, включающий внедрение в образец, содержащий области,ограниченные мембранами, парамагнит-ных ионов и воздействие на образецсерии 90-180-180 о радиочастотныхимпульсов. Этот способ используетсядля исследования проницаемости биологических мембран и заключается втом, что во внеклеточное пространство вводятся парамагнитные ионы, например, марганца Мп , и образец под+2вергают воздействию серии радиочастотных импульсов 90 - ь -180 -2 ь - ЗОО л а ло180 - , так называемой последовательности Карра-Парсела-Мейбума-Джилла (К 1 ПЩ). В результате наблюдаетсябыстрое релаксационное затухание намагниченности с характеристическим З 5временем Т 2 от протонов воды внесклеточного пространства, обусловленное релаксацией на парамагнитныхионах, и медленное - со временем Тот протонов внутриклеточной воды. 40Проницаемость клеточной мембраныобеспечивает обмен воды вцутриклеточного и вцеклеточного пространствачто приводит к ускорению наблюдаемогозатухания намагниченности от внутриклеточной воды. Это ускорение зависит от величины проницаемостимембраны и используется для количественнойее оценки 21 .,Однако в известном способе уско Орение релаксации внутриклеточной вбды может быть обусловлено как обменом, так и проникновением парамагнетика внутрь клеток. Следовательно,для измерения обмена этим методом 55предварительно необходимо установитьсам Факт существования обмена,Цель изобретения - однозначноеобнаружение протонной проницаемости мембран и увеличение точности измерений.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу обнаружения протонного обмена в гетерогенных системах, включающему внедрение в образец, содержащий обпасти, ограниченные мембранами, парамагнитных ионов и воздействие на образец серии 90-180 о180радиочастотных импульсов, исследуемый образец дополнительно подвергают воздействию двух 180-градусных импульсов, разделенных интервалом, которые включаются перед се" рией импульсов, причем интервал между моментом включения второго дополнительного импульса и серией импульсов определяют по отсутствию сигнала свободной индукции после пробного 90- градусного импульса и по наличию изменения крутизны спада поперечной намагниченности от интервала 11 обнаруживают обмен.На чертеже приведены временные диаграммы включения радиочастотных импульсов. На чертеже изображены первый 1и второй 2 дополнительные 180 -градусные импульсы, 3 - серия импульсовКПМД и 4 - огибающая затухания сигналов спин - эхо,Второй дополнительный импульс следует через изменяемый интервал 1после первого, при этом ь, ъ Т,Фгде Т - время, за которое продольная компонента намагниченности области беэ парамагнетика уменьшится вдва раза от своего первоначальногозначения. По зависимости измеряемого времени поперечной спин-спиновойрелаксации Т 2 от интервала 1 опьределяется наличие обменного механизма релаксации, так как для обменивающихся протонами областей с различными временами релаксации затуханиемедленно спадающей компоненты поперечной намагниченности изменяетсяпри вариации 1 а для необменивающихся - не изменяется,Идейная основа предлагаемой импульсной последовательности построена на том, что для областей с различными временами релаксации Т 2 ) Тц,но не обменивающимися протонами,медленно спадающая компонента поперечной намагниченности при измененииизменяет только свой долевой вкладв общую намагниченность, время релаксации при этом не изменится. Если же существует обмен, скорость которого 1/Т( 1/ ь ( 1/Т , то при изменении и изменяется значение 1/Т 2, т.е. при наличии обмена не все про 2 ь тоны внутриклеточной области 7 за время 1 отрелаксируют за счет выхода в область быстрой релаксации - внеклеточную область Ча. Оставшаяся часть протонов испытывает радиочас- О тотное насыщение продольной намагниченности и не дает вклада в намагниченность к моменту времени 11 , Изменение 1 приводит к изменению эффективного объема протонов, дающих 5 вклад в сигнал, и, следовательно,л учитывая,что время обменасвязано с коэффициентом проницаемости мембран Р, объемом М и площадью мембраны 5 соотношением 20л Р 5Бо6имеет место зависимость 1/ь = 1 ( 1).Таким образом, изменение интервала 25и наблюдение за скоростью затухания поперечной намагниченности дают возможность экспериментальной оценки существования обменного механизма релаксации, 30Таким образом, второй 180-градусный импульс служит для нормировки быстро и медленно релаксирующих компонент намагниченности, т.е. создает условия для выбора момента включения последовательности КПИД, когда доли35 компонент намагниченности равны, независимо от их начального соотношения в суммарной начальной намагниченности, при этом спад поперечной40 намагниченности представляет собой не сумму, а разность компонент (огибающая 4).Для оценки эффективности предлагаемого способа проведены измерения 45 на образцах, содержащих области, заведомо не обменивающиеся протонами, и на образцах, где этот обмен существует.В первом случае образец представ ляет собой ампулу с водным раствором соли парамагнетика ЫвС в которую помещают ампулу меньшего диаметра с раствором парамагнетика другой концентрации, что обеспечивает необ ходимое различие времен релаксации.При измененииот 4 с до 200 мс амплитуда сигнала подавляется радиочастотным насьпцением в 2-3 раза, но затухание медленно спадающей компоненты не изменяется, Т 2 остается постоянным, равным 47 мс.В качестве объекта с обменивающимися областями взяты водоросли К 1 сса, которые инкубировались в 50 мЫ растворе ИСС . Затухание поперечной намагниченности удовлетворительно разделяется на две компоненты и при изменении 1 от 6 с до 70 мс наблюдается отчетливое изменение скорости затухания медленно спадающей компоненты намагниченности от 80 мс до 15 мс. Изменения Т 2 свидетельствуют о том, что в данной системе изменение скорости релаксации 1/Т 2 Ь при введении парамагнетика контролируется обменом. Предлагаемая последовательность может быть полезной для исследования обмена в любых системах, содержащих области протонов с различными временами релаксации, а также для исследования транспорта парамагнитных ионов в биологические клетки.Использование предлагаемого способа измерения времени магнитной релаксации в гетерогенных системах позволяет однозначно интерпретировать данные по ускорению времени релаксации в методе КПМД, а также дает информацию об обменном механизме релаксации в гетерогенных системах, где существует выраженньп двухкомпонентный спад ядерной намагниченности,Способ разработан и испытан применительно к исследованиям водопрониФцаемости биологических мембран, однако может быть применен и в других отраслях народного хозяйства, где используются гетерогенные системы, например в промышленности химического гетерогенного катализа для оценки эффективности катализаторов через измерение скорости обменных процессов, в нефтяной промьппленности для измерения пористости нефтесодержащих сред через измерение скорости проникновения парамагнитных ионов, искусственно вносимых в образец, в промышленности, производящей молекулярные сита и искусственные мембраны для оценки проницаемости при помощи молекул с посаженными на них парамагнитными метками и с последующим измерением времени релаксации и т.д.Заказ б 449/29 Тираж 822 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная,Способ зкспрессивен, позволяетпроводить измерения за 5-10 мин,объект исследования может иметь про-. йзвольиув Форму, безопасен для обслуживаощего персонала.