Способ получения иммунной сыворотки против инсулина

"В 1 о-. ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРИТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(56) 1, В гц рпап Т, И.,С 1 гсц 1 агРгспго 1 с апдяшй 1 ез ой зггцс 1 цге КоГ Лпзац 11 п апй Регхчагсйеп.аггу", 1973, ч. 1р. 727-732,(54)(57) СПСЫВОРОТКИ П мунизации м с добавлени ч а ю щ и увеличения в качестве ливинилпирр 50000 в кол ИЯ ИММУННОИ А путем иминсулином отлис цельюго продукт ольз уют по весом 3000 0,30 г. ОСОБ ПОЛУЧЕН РОТИВ ИНСУЛИ орских свина ем адьюванта с я тем, чт выхода целев адьюванта исп олидон с мол ичестве 0,15Изобретение относится к медицине,а именно к способам получения диагностических препаратов, в частностик способу получения гиперимунной сыворотки против инсулина. 5Известен способполучения имуннойсыврротки против инсулина путем иммунизации морских свинок с добавлением адьюванта1 1,Однако использование адьюванта 10Фрейнда ведет к массовой гибели морских свинок, что в свою очередь снижает возможность получения достаточного количества антисывороток противинсулина.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта,Указанная цель достигается способомполучения иммунной сыворотки противинсулина путем иммунизации морских 20свинок инсулином с добавлением адьюванта, в качестве адьюванта используют поливинилпирролидон с мол,весом30000-50000 в количестве О, 15-0,30 г.П р и м е р 1, Для иммунизации ис пользовали 30 морских свинок (самцы,беспородные - трехцветные, масса400 г).В 1-й день вводят по 1 мл раствораинсулина (150 мкг/мл) в 237, поливинил-зопирролидона (ПВП) внутримышечно вобласть подколенных лимфоузлов пе 15 редних и задних лап. На 8-й день вводят по 1 мл раствораинсулина (150 мкг/мп) в 23% ПВП внутри-35мышечно и внутрибрюшинно.На 15-й день вводят по 1 мл(150 мгк/мл) в 237 ПВП внутримышечнои внутрибрюшинно.На 45-й день вводят по 1 мл раство.ра инсулина (150 мкг/мл) в 237 ПВП внутримышечно и внутрибрюшинно.На 7-й день после последней инъекции проводят частичное кровопускание из сердца (по 5-10 мл). Первую реиммунизацию проводят через 30 дней после взятия крови, вводя 1 мл раствора инсулина (150 мкг/мл) в 237 Г 1 ВП внутримышечно и внутрибрюшинно, Последую 50 щие циклы реиммунизации проводят аналогично. Титры антисывороток определяют непрямым методом иммуноферментного анализа. Титр антисыворотки от данной морской свинки несколько увеличивался от цикла к циклу и составлял: от 10 свинок - 1/10 000, от 15 свинок - 1/20 000, от 4 свинок 1/40 000. ПВП используют в количестве О, 150,30 г. В примере описано использование для иньекций 1 мл раствора ин -сулина в 237 ПВП, что соответствует0,23 г ПВП на иньекцию, т.е. среднемузначению количества, указанного винтервале возможных значений.Нижняя граница интервала обусловлена тем, что при использовании такого количества ПВП увеличиваетсячисло свинок, дающих антисывороткус низким титром, Верхняя граница интервала обусловлена растворимостьюПВП.П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но используют раствор инсулина, 1 мл которого содержал0,15 г ПВП. Все свинки оставались живы. Титр антисыворотки составил: от20 свинок - 1/10 000,от 2 свинок1/40 000.П р и м е р 3. Способ осуществляют по примеру 1, но используют раствор инсулина, содержащий 0,3 г ПВП.Результаты аналогичны полученным впримере 1,Поливинилпирролидон выпускаетсяпромышленным способом и широко используется в медицине как кровезаменитель и пролонгатор действия различ -ных лекарственных преператов.Повышение иммуногенных свойств инсулина в присутствии поливинилпирролидона по видимому связано с образованием электростатического комплекса,что, с. одной стороны, увеличиваетразмер молекулы инсулина, с другой -замедляет его вывод из организма. Способ осуществляют по выбранной схемеиммунизации. Частичное кровопусканиеиз сердца (5 мл) осуществляют на7-й день после последней инъекции,Первую реиммунизацию проводят через,30 дней. Все морские свинки на протяжении 5 циклов иммунизации, которые проводились в течение 6 мес, оставались живы, чувствовапи себя хорошо, образования подкожных язв не наблюдалось. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать гипериммунную сыворотку с высоким титром. Антисыворотка может быть использована в радиоизотопном и иммуноферментном анализе при количественном определении инсулина в биологических жидкостях.Применение поливинилпирролидона в качестве адьюванта позволяет исполь1099954 зовать животных для получения антисывороток в течение продолжительноговремени (бмес, 5-7 циклов реиммунизации),При использовании для инъекцийраствора инсулина, содержащего 0,150,30 г/мл ПВП приводит к получениюантисыворотки с высоким титром, приэтом по сравнению с использованиемадьюванта Фрейнда увеличивается количество антисыворотки за счет того,что животные при иммунизации не гибнут, от 30 морских свинок получено213 мл сыворотки.СпециФичность антиинсулиновой сыворотки проверяли в реакции преципитации методом двойной диффузиив гель по Оухтерлони и в реакциииммуноферментного анализа (ИФА) сиспользованием в качестве антигенаинсулин, пролактина, глюкагона, выделенных из поджелудочной железы.Для реакции препитации использовали штамм У 7. В центральную лунку .вносили неразведенную антиинсулиновуюрсыворотку, исследуемый антиген раститровывали вокруг центральной лункив следующих разведениях: 1, 1/2, 1/4,1/8, 1/1 б, 1/32, начиная с исходнойконцентрации антигена 0,3 мг/мл. Реакция выявила четкую линию преципитаАнтиген+ нормальная сыворотка 1,0 0,4 0 0,08 О, 01 Значение оптической плотности раствора при 1 = 450 нм Пролактин + нормальнаясыворотка ции во всех разведениях антигена только в случае инсулина. Перекрестных реакций антиинсулиновых сывороток с антигенами глюкагоном и пролактином не наблюдали.Для проверки специфичности антиинсулиновой сыворотки использовали также непрямой метод ИФА, На поверхность полистироловых микроплат сорбировали антигенинсулин, глюкагон или пролактин, затем в лунки микроплат вносили иммунную сыворотку в разведениях 1/10, 1/50, 1/100, 1/1000. Антитела, содержащиеся в имунной сыворотке, взаимодействовали с антигеном, образуя комплекс антиген-антитело, который выявляли с помощью вторых антител, меченных ферментом (кроличьих антител к иммуноглобулинам морской свинки, ковалентно связанных с пероксидазой). В качестве субстрата пероксидазы использовали 5-аминосалициловую кислоту и перекись водорода. В результате ферментативной реакции наблюдали образование окрашенного продукта с максимум поглощения при,гД = 450 нм. Чем больше антител в исследуемом разведении сыворотки, тем больше образовывалось окрашенного продукта и, следовательно, больше значение оптической плотности (см. таблицу). Разведения сывороток 1 1 11099954 Составитель Г, КрюковаТехред Ж. Кастелевич Корректор М. Шароши Редактор Н. Швыдкая Заказ 45 19/6 Тираж 688 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Как видно из данных таблицы, значения оптической глотности в реакциях пролактина и глюкагона с антиинсулиновой сывороткой одинаковы со значениями оптической плотности контрольной реакции инсулин + нормальная сыворотка морской свинки, Таким образом, исследуемая антиинсулиновая сыворот,ка не реагирует с глюкагоном и пролактином, тогда как с инсулином ре" агирует при большом разведении, Титр исследуемых антиинсулиновых сывороток, полученных от различных животных, в реакции с инсулином колебалсяв пределах 1/10000-1/20000. Предлагаемый спос.об позволяет получать сыворотку с высоким титром к инсулину, сократить расход морских свинок за счет снижсния их смертности и тем самым повысить выход антисывороткн,