Способ определения стероидных сапонинов и сапогенинов

.50 С 01 Я 31/08 ГОСУДАРСТВЕНКИЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.П.Кемертекисн- ийяето.ного А. и пред связ дио адна лени нног коре био 92,Нозс 1 очеав 1 опасЬегЬа ро 9 опф,тотип)и АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНИХ САПОНИНОВ И САПОГЕНИНОВ путемтонкослойного хроматографированияраствора анализируемого веществар по(жЕдующей обработкой силикагеля при нагревании в присутствиихлороформа цветореагентом, содераащим концентрированную сернуюлоту, и фотометрирование полученого раствора, о т л и ч а ю щс я тем, что, с целью повышениточности способа, в качестве цвреагента используют смесь уксусангидрида и концентрированной серной кислоты, взятых в объемном соотношении 9:1, и обработку ведут п35-40 еС.1043560 Таблица 1 Изобретение относится к аналитической химии природных органических соединений, преимущественно к способу количественного определения стероидных сапонинов и сапогенинов.Известен способ определения сте роидных сапонинов и сапогенинов путем экстракции из растительного сь рья, распределительном хроматографировании, получении пятна исследуемого вещества, обработки его на Г) греванием при 60 С со смесью конценторированной серной кислоты и водного формальдегида в течение 15 мин с последующим фотометрическим определением 1 ,15Недостатком этого способа является то, что сапонины и сапогенины при нагревании со смесью концентрирован 4 1,11 0,00925 ф 0,043 0,95 Однако сапонины и сапогенины при нагревании с концентрированной сер- З 0 ной кислотой не дают устойчивой во времени окраски, что приводит к относительно невысокой точности.Целью изобретения является повышение точности способа, 35Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения стероидных сапонинов и сапогенинов путем тонкослойного хроматографирования раствора анализируемого вещест ва с последующей обработкой силикагеля при нагревании в присутствии хлороформа цветореагентом, содержащим концентрированную серную кислоту, и фотометрированием полученного раствора. В качестве цветореагента используют смесь уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты, взятых в объемном соотношении 9:1, и обработку ведут при 35-45 С.П р и м е р 1, Определение дигитонияа в семенах наперстянки красной.2 г (с точностью до 0,01 г) семян наперстянки красной, измельченных в просеянных сквозь сито с диамет- .55 ром отверстий 0,25 мм, обезжиривают в аппарате Сокслета экстракцией петролейным эфиром в количестве 20 мл в течение 12 ч, Обезжиренные семена высушивают на воздухе, 60 помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 60 мл 70-ного этилового спирта, закрывают колбу пробкой, взвешивают (с точностью до 0,01 г) и выдерживают 1 ч, Затем содер ной серной кислоты и водного формальдегида не дают устойчивой во времениокраски, что приводит к невысокойточности способа,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемымрезультатам является способ определения стероидных сапонинов и сапогенинов путем тонкослойного хроматографирования раствора анализируемого вещества, обработки силикагеля цветореагентом - концентрированной серной кислотой в присутствии хлороформа при 60 С и Фотометрированием полученного раствора ( 2(,Метрологическая характеристика известного метода количественного определения дигитонина приведена втабл,1. 2,77 0,16128 0,11911 - + 10,7 жимое колбы соединяют с обратным холодильником, нагревают до кипения и поддерживают слабое кипение жидкости в течение 2 ч. По охлаждении колбу с содержимым вновь закрывают пробкой, взвешивают и убыль в весе пополняют 70-ным этанолом. Жидкость тщательно взбалтывают, фильтруют через сухой фильтр в СУХУЮ КРУГЛОДОННУЮ КОЛЛУ И ОТГОНЯ- ют под вакуумом на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в смеси хлороформ-этанол (1:1), переносят в колбу емкостью 25 мл и объем доводят тем же растворителем до метки (раствор А).Хроматографирование. Пластинку с силикагелем размером 1420 см делят на три равные части, обозначенные номерами 1-3. 0,25 г (точная навеска) высушенного дигитонина при 105 помещают в мерную колбу емкостью 25 мл, доводят до метки системой хлороформ-метанол-вода (65:35:10) - раствор Б. На первую и вторую полоски наносят 0,2 мл раствора й, на третью полоску 0,2 мл раствора Б. Пластинку высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в системе хлороформ-метанол- вода (65:35:10) дб поднятия фронта растворителей на 18 см. После этого пластинку выдерживают в сушильном шкафу при 800 в течение 5 мин и рассматривают в УФ-свете, На уровне проявленного пятна стандартного дигитонина обводят Участки на полосках 1 и 2, С отмеченных)0435 бо Ч - количество сгущенного спир 2тового извлечения, нанесенного на пластинку дляхроматографирования, мл;Ч - объем окрашенного раст 35вора, мл;С, - концентрация раствора стандартного образца дигитонина;0 - оптическая плотность раствора стандартного образца 10 ди ги ги тони на;Ь - потеря в весе при высушивании;О - оптическая плотность исследуемого раствора. 5 Содержание дигитонина в семенахнаперстянки красной 3,7. Метрологическая характеристика метода количественного определения дигитонинав семенах наперстянки красной приведена в табл.2. Таблица 2 Р 1(р Г) Дх 9 3,98 0,0101 0,1005 95 2,2 б +0,2271 5,7+3,29 П р и м е р 2. Определение тигогенина в кюке славной.2 г измельченных листьев юкки славной, просеянной сквозь сито с диаметром отверстий 0,1 мм, помеща- З 5 ют в колбу емкостью 100 мл, заливают 42 мл 50-ного этилового спирта, взбалтывают и нагревают в течение 20 мин на кипящей водяной бане с обратным холодильником, Затем до бавляют 8 мл концентрированной НСР и нагревают в течение 3 ч, Массу после нейтрализации 10-ным ИаОН помещают в делительную воронку емкостью 50 мл и извлекают 7 раз по . 45 15 мл хлороформом. Хлороформные из влечения переносят в круглодонную колбу вместимостью 20 мл и отгоняют под вакуумом на ротационном испари теЛе досуха. Остаток РаствоРяют в хлороформе, переносят в колбу емкостью 25 мл и объем доводят тем же растворителем до метки (раствор А).Пластинку с силикагелем размером 14 ф 20 см делят на три равные части, обозначенные номерами 1-3.0,25 г (точная навеска) высушенного,тигогенина при 1.05 помещают в мерную колбу 25 мл и доводят до метки хлороформом (раствор Б). На первую и вторую полоску наносят 60 0,2 мл раствора 2, на третью полоску 0,2 мл раствора Б. Пластинку высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в системе хлороформ-этанол (24:1) до поднятия фрон участков по отдельности выскабливают силикагель, переносят в колбыемкостью 25 мл, добавляют по 7 млсмеси уксусного ангидрида с сернойкислотой (9:1) и в ультратермостате выдерживают в течение 30 минпри 40 С. Объем жидкости в мерныхколбах доводят до метки хлороформом, Измеряют оптическую плотностьфильтратов на фотоколориметре ФЭК с использованием светофильтра Р 3Р= 400+5) в кюветах толщиной слоя10 см. Содержание дигитонина вычисляется по формуле Р Сст ЧдЧ 100 100Рс 1 Ч 2 а (100-Ь) ф где а - навеска сырья, г;Ч 1 - объем сгущенного спиртового извлечения, мл; та растворителей на 18 см. Пластинкувыдерживают в сушильном шкафу при80 в течение 5 мин и рассматривают в УФ-свете. На уровне проявленного пятна стандартного тигогенинаобводят участки на полосках 1-2, Сотмеченных участков по отдельностивыскабливают силикагель, переносятв колбы емкостью 25 мл, добавляютпо 7 мл смеси уксусного ангидридас серной кислотой (9:1) и в ультра-,термостате выдерживают в течение30 мин при 40 С. Объем жидкости вмерных колбах доводят до метки хлороформом, Измеряют оптическую плотность фильтратов на фотоколориметреФЭКб с использованием светофильтра 9 3 (Л=. 400+5) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Содержание тигогенина вычисляют по формуле (1). П р и м е р 3. Количественное ,определение дигитонина в готовом продукте.0,25 г (точная навеска) дигитонина помещают в 25 мл мерную колбу, растворяют в смеси хлороформ-метанол (1:1) и объем доводят тем же растворителем до метки (раствор А).Приготовление стандартного раствора дигитонина (раствор Б). 0,25 г (точная навеска) высушенного дигитонина при 105 помещают в 25 мл мерную колбу, растворяют в смеси хлороФорм-метанол (1:1) и объем доводят тем же растворителем до метки.35 П б 100100С Х П с а(100-Ь) 50 55 Таким образом, предлагаемый спо" 60 соб позволяет повысить точность оп, ределения стероидных сапонинов исапогенинов. Относительная ошибкаанализа уменьшается с + 10,7 до 5,7. Тираж 873 ПодписнееУжгород, ул, Проектная,ПЛастинку с силикагелем размером 14 20 см делят на три равные части. На первую и вторую полоски наносят 0,2 мл раствора й, на третью полоску 0,2 мл растнора Б.Пластинки .высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в сис, теме хлороформ-метанол-нода(б 5;35:10) до поднятия фронта растворителей на. 18 см. Пластинки выдерживают в.сушильном шкафу при 80 С н 1 О течение 5 мин. Пластинку рассматри 1 вают в УФ-свете. На уровне проявления пятна стандартного дигитонина обводят участки на полосках 1 и 2. С выделенных участков по отдель ности снимают силикагель, переносят в колбы емкостью 25 мл, добавляют по 7 мл смеси уксусного ангидрида с серной кислотой (9:1), помещают в ультратермостат и выдер- з 0 живают в течение 30 мин при 40 . После этого добавляют по 10 мл хлороформа, фильтруют через бумажный фильтр н мерные колбы по 25 мл, Колбы неоднократно споласкивают 5 мп хло роформа и промывают фильтр. Объем жидкости н мерных колбах доводят до метки хлороформом. Измеряют оптическую плотность фильтратов на фотоколориметре ФЭКс использованием светофильтра М 3 (Л= 400+5) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Содержание дигитонина вычисляют по фор- муле где Э - оптическая плотность испытуемого раствора;Э - оптическая плотность станодартного раствора;а е навеска испытуемого дигитонина;б - навеска стандартного раствора дигитонина;Ь - потеря в весе при высушивании.Содержание дигитонина н препарате должно быть не менее 96 в пересчете на сухое вещество.П р и м е р 4, Способ определения тигогенина в готовом продукте.0,25 г (точная навеска) тигогенина помещают н 25 мл мерную колбу, растворяют в хлороформе и объем доводят 1 ем же растворителем до метки (раствор А) .Приготовление стандартного раствора тигогенина (раствор Б). 0,25 г (точная навеска) высушенного тигогенина при 105, помещают в 25 мл мерную колбу. Доводят объем до метки хлороформом.Пластинку с силикагелем размером 10 20 см делят на три равныеВНИИПИ Заказ 7330/47Филиал ППП Патент , г. части, Па первую и нторую полоски наносят 0,2 мл раствора Л,на третью полоску 0,2 мл раствора Б,Пластинки высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в системе хлороформ-этанол (25:1) до поднятия фронта растворителей на 18 см, Пластинки выдерживают в сушильном шкафу при 80 в течениео5 мин. Пластинку рассматривают в Уфсвете, На уровне проявленного пятна стандартного тигогенина обводят участки на полосках 1 и 2. С выделенных участков по отдельности снимают силикагель, переносят в колбы емкостью 25 мл, добавляют по 7 мл смеси уксусного ангидрида с серной кислотой (9:1), помещают н ультратермостат и выдерживают в течение 30 мин при 40. После этого добавляют по 10 мл хлороформа, фильтруют через бумажный фильтр в мерные колбы по 25 мл, Колбы неоднократно споласкивают 5 мл хлороформа и промывают фильтр. Объем жидкости в мерных колбах доводят до метки хлоро- формом, Измеряют оптическую плотность фильтратов на фотоколориметре ФЭКс использованием светофильтра Р 3 ( Ъ = 4005), н кюветах толщиной слоя 10 мм, Содержание тигогенина вычисляют по укаэанной формуле.Содержание тигогенина в препарате должно быть не менее 80 в пересчете на сухое вещество.П р и м е р 5. При увеличении уксусного ангидрида в соотношении 10:1 с концентрированной серной кис" лотой нарушается стабильность окраски во времени, т.е. невозможно точное определение количественного содержания целевого продукта.П р и м е р 6. При уменьшении уксусного ангидрида н соотношении 8:1 с концентрированной серной кислотой нарушается стабильность окраски во времени, т.е. невозможно точное определение количественного содержания целевого продукта. П р и м е р 7, При изменении оптимального времени с 30 мин на 20 мин наблюдается снижение стабильности окраски во времени н течение 12 ч.П р и м е р 8. При изменении оптимальной температуры с 40 О на 25 С наблюДается снижение стабильности окраски в течение 24 ч.