Способ определения степени тяжести гипоксии мозговой ткани

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСИИХРЕСПУБЛИК САНИЕ ИЗОБРЕТГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(72) Е.М.Хватова, А.Н.Сидоркина, Г.В,Миронова и И.Н.Балишина (71) Горьковский медицинский институт им. С.М.Кирова(56) 1. Саратиков А,С., Волошина Э.И Энергетический обмен мозга при острой гипоксической гипоксии.- Извести СО АН СССР, сер. бнол. наук. 1971, Р 5,1, 119-126 (аналог).2. Ьоыгу О.Н. Раззоппеа НаззеЬегдег Л,Х. апй БоЬц 1 Еййесй ой БсЬев 1 Й оп Кпо 1 ев апй согасгогз ой д 1 усо 1 уМв реЖ юау 1 п Ьга 1 п 7.В 16 СЬев 1 зггу 1964, 239, р, 18-30.(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИТЯЖЕСТИ ГИПОКСИИ МОЗГОВОЙ ТКАНИ путсоздания гипоксического состояния уэкспериментального животного,умерщвления мгновенным замораживанием животного с последующим извлечением мозговой ткани и определением в ней аденоэинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина, о т л и ч а ю щ и й - с. я тем, что, с целью дифференцирования степеней тяжести гипоксии, в мозговой ткани дополнительно определяют содержание гуанозинтрифосфорной кислоты и при снижении содержания гуано-ф эинтрифосфорной кислоты на 30-50 относительно нормы и при нормальном содержании аденоэинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина определяют легкую степень гипоксии, при снижении гуанозинтрифосфорной кислоты на 51-70 и аденозинтрифосфорной кислоты на 20-40при нормальном содержании фосфокреатина определяют среднюю степень гипоксии, а при снижении гуанозинтрифософрной кислоты на 71-90, аденозинтрифосфорной кислоты на 50-70, а фосфокреатина на 40-60 определяют Я тяжелую степень гипоксии мозга;ЬвйИзобретение относится к медицине,а именно биохимическим способам оценки тяжести гипоксии ткани.Известен способ определения .степени тяжести гипоксии мозговой ткани,включающий исследование содержания 5макроэргических фосфатов (1).Однако степень изменения этих соединений может быть невелика даже приострых и глубоких нарушениях снабжения кислородом чувствительных к гипок сии органов и тканей.Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ определения тяжестигипоксии мозговой ткани путем создания гипоксического состояния у экспе риментальных животных, умерщвления,мгновенным замораживанием животногос последующим извлечением мозговойткани и определением в ней аденоэинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина 2) .Однако .известный способ не позволяет дифференцировать легкую, среднюю н тяжелую формы гипоксии, а также выявить гипоксическое .повРеждениеткани на самых ранних стадиях.Цель изобретения - дифференцирование степеней тяжести гипоксии.Поставленная цель достигается тем,что в способе определения степенигипоксии мозговой ткани. путем создания гипоксического состояния у экспериментального животного, умерщвлениямгновенным замораживанием животногос последующим извлечением мозговойткани и определением в ней аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина,отличительной особенностью являетсято, что в мозговой ткани дополнительно определяют содержание гуанозинтриФосфорной кислоты и при снижении со.держания гуаноэинтрифосфорной кислоты на 30"50 относительно нормы ипри нормальном содержании аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатинаопределяют легкую степень гипоксии, 45при снижении гуаноэинтрифосфорнойкислоты на 51"70 и аденозинтрифос.Форной кислоты на 20-40 при нормаль"ном содержании фосфокреатина определяют среднюю степень гипоксии, а приснижении гуанозинтрнфосфорной кислоты на 71-90, аденоэинтрифосфорнойкислоты на 50".70, а фосфокреатина. на 40-60 определяют тяжелую степеньгипоксии мозга,Способ осуществляют следующим образом.Исследуемую ткань помещают в жидкий азот, замораживают, затем растирают в тонкий порошок в ступке с жидким азотом. Навески ткани берут в бОпредварительно тарированные бюксы,содержащие слегка замороженный 10-йраствор трихлоруксусной кислоты на0,5 м ЭДТА из расчета 10 мл/г ткани.Пробы экстрагируют в течение 20 мин 65 и фильтруют через бумажные фильтры. ТХУ удаляют трехкратным встряхиванием (по 2 мин) с двумя объемами серного эфира, насыщенного водой. Следы эфира удаляют аэрацией, экстракт нейтралируют до 7,0-7,4 0,1 ИИаОН.ФКр определяют по Эннору и Розенбергу. Для этого пробу помещают в мягкие условия гндролиза (9 мин в 0,4 ИНС 1 прн 1 6 Я . Затем раствор нейтрализуют добавлением 0,4 ИИаОН и быстро охлаждают до комнатной тем-. пературы. Затем добавляют 0,5 мл 0,004 М раствора пара-хлормеркурий бензоата (ПХМБ), 1 мл 1-го раствора "нафтола и 0,5 мл 0,05-го раствора диацетила. Объем доводят до 5 мл водойСодержимое перемешивают, ставят на 30 мин в темноту, Затем измеряют оптическую плотность раствора на ФЭКе при длине волны 540 нм. Нуклеотиды разделяют методом колоночной хроматографии на эктеола-целлюлозе.в С 1-форме. Количество их определяют по поглощению в ультрафиолете наспектрофотометре Сф, Нужную фракцию целлюлозы (150 меш) взвешивают в десятикратном объеме воды, дегазируют и в форме суспенэии.вносят в колонку размером 770 мм. Сорбцию нуклеотидов проводят со скоростью вытекания раствора 0,07-0,0 В мл/мин. Колонку промы- вают 2-мя мл воды, а затем нуклеотиды элюируют ступенчато растворами НС 1возрастакщей концентрации (от 0,011 И до 0,1 И) со скоростью 0,12- 0,16 мл/мин. Сбор фракций проводят капельным методом, Объем каждой фракции доводят до 3 мл, а конечную концентрацию НС 1 - до 0,1 И. Оптическую плотность измеряют на С 4-16 с толщиной слоя 1 см при длинах волн 260- 290 нм для АТФ и 260-310 нм для ГТФ. Расчет концентраций нуклеотидов про" водят по коэффициентам молярной экстинции: 14300.- для АТФ, 12200 - для ГТФ. Возвратсуммарной экстинции с колонки составляет 98-100.После определения ссдержания ГТФ, АТФ н фрк в мкй/г ткани полученные данвые сравнивают с нормой. При атом нормальное для данной ткани содержание ГТФ, АТФ и Фрк принимают за 100. Содержание ГТФ, АТФ и Фкр в исследуемой на гипоксию ткани выражают вк норме. Рассчитывают разницу между содержанием ГТФ, АТФ, фкр и при гипоксии (в ) и при снижении ГТФ на 40-44 относительно норьы и стабильности АТФ и фкр диагностируют легкую степень гипоксии 1 при снижении ГТФ на 45-50,АТФ на 10-30 и стабильности фкр диагностируют среднюю степень тяжести гиноксиипри снижении ГТФ на 60 и более,АТФ на 50 и более,фкр на.50 и более - тяжелую форму гипоксии.Примеры конкретного исполнения способа.,1020777 40 Содержание исследуемых компонентов (мкИ/г ткани мозга) Гипоксия ФКР Норма: кролики 0,24+0,03 1,76+006 2,0810,07 1,63+0,08 2, 53+ 0,14 033+0,02 3, 03+0,18 крысыГипоксическая(крысы) 2,08+0,07 0,14+0,03 3,2310,21 П р и м е р 1. Для определения степени тяжести гипоксического повреждения ткани мозга у кролика, выдержанного в течении 30 мин в барокамере на высоте 7000 м, в ткани мозга определяют содержание ГТФ, АТФ, ФКр. В нор". 5 ме содержание этих компонентов в мозге кроликов, следующее: ГТФ - 0,24 + 10,03 мкМ/г ткани) АТФ - 1,76+ й 0,06 мкМ/г тканиу ФКр - 2,53+ +0,14 мкМ/г ткани. 10В исследуемой ткани содержание оп" . ределяемых компонентов таково: ГТФ - 0,16 мкМ/г ткани; АТФ 1,72 мкМ/г ткани; ФКр,80 мкМ/г ткани.Следовательно, имеется снижение 15 содержания ГТФ на 33 относительно яормы, АТФ и ФКр стабильны, Эти изменения соответствуют легкой степени гипоксического повреждения, Ранее известные способы не позволяли выя О вить начавшиеся изменения энергетического обмена.П р и м е р 2; В исследуемой ткани выявлены значительные нарушения энергетического обмена, свидетельствующие о возникновении гипоксии, С целью оценки тяжести гипоксического. повреждения ткани мозга проведено определение содержания в ней ГТФ, АТФ и ФКр по предлагаемому способу, Получены следующие результаты: АТФ - 1,40 мкИ/г ткани,.против 3,03 + 0,18 мкИ/г ткани в норме 1 ГТФ,14 мкМ/г ткани против 0,33+0,002 в норме; ФКр - 3,05 мкИ/г ткани про" тив 3,0310,18 в норме.35 Таким образом, выявлено снижение2"х компонентов: АТФ на 33, ГТФ -на 58, что соответствует среднейстепени тяжести гипоксии. П р и м е р 3, В исследуемой ткани содержание ГТФ, АТФ, ФКр следую".щее: .ГТФ - 0,09 мкМ/г против 0,33 мкМ/гг 0,02 в нормеу АТФ - . 45 0,79 мкИ/г против 2,08 мкМ/гй 0,07 в норме; фкр - 1,47 мкМ/г против 3,03 ф0,18 в норме,То есть, содержание АТФ сниженона 62, ГТФ - на 73, Фкр - на 52,что соответствует тяжелой форме гипоксии. Анализ проведен вслепую. Была взята ткань мозга крысы, подвергшейся действию циркулятора гипоксиив течение 18 ч (35 животных послетакой экспозиции гибнут, что является одним иэ подтверждений крайне тяжелых и необратимых нарушений энергетического обмена),.Исследованиями ткани мозга 50-тиэкспериментальных животных, подверг-шихся действию гипоксии различного вида и длительности и контрольной группы (46 опытов) установлено наличиеглубоких коррелятивных связей между.изменениями комплекса АТФ, ГТФ, фкри,тяжестью гипоксического новреждения ткани.Гипоксическая гипоксия в барокамере на высоте 7000 м в течение 30 мин(принятая модель легкой степени тяжести гипоксии) характеризуется сле"дующими изменениями комплекса АТФ,ГТФ, Фкр в ткани мозга кроликова Фкрстабилен, 2,83 мкМ/г ткани мозга(112 против 100 - различие недостоверно); АТФ - не изменяется, 1,710,06 против 1,.76+0,06 мкМ/г ткани внорме (97 против 100 - различие недостоверно) ГТФ - снижается на 43,4,0,16 мкМ/г ткани мозга ф 0,03 против0,24-0,03 в норме,Пребывание в барокамере на высоте8000 м в течение 30, а также перевязка общих сонных артерий на 30 мин(модели гипоксии средней тяжести) вызывали снижение ГТФ на 45, АТФ на10-30, ФКр - оставался стабильным.В таблице показано содержание АТФ,ГТФ, ФКр в мозге экспериментальныхживотных (кролики, крысы) в норме ипри гипоксической и циркуляторной гипоксии средней тяжестиЗаказ 3892/39 Тираж 873 Подписное ВЫКИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий. 113035, Москва, щ, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП еПатентф, г.ужгород, ул.Проектная, 4 При циркуляторной гипоксии экспозицией 18 ч(модель тяжелой формы гийоксии мозга) нарушалась стабильность всех трех компднентовгГТФ - снижалась на.73 и более(до 0,09 мкМ/г ткани +0,04 - 0,33 мкМ/г ткани + 0,02 в 5 йорме) АТФ - на 62 Ь (до, 079 мкМ/г ткани й 0,06 с, 2,08 мкМ/г ткани +0,07 в норме)у ФКр - на 50 и более (с 3,03+0,18 мкМ/г ткани в норме до 1,47+0,16 мкМ/г ткани).Определение содержания ЬТФ, ГТФ, ФКр в ткани мозга экспериментальнык животных проведено в 11 опытах на модели легкой формы гипоксии, в 16 опы" тах на моделях средней формы гипок сии (8 - гипоксическая гипоксия и 8 циркуляторйая гийоксия)и в 23 опытахс тяжелой формой гипоксии.Предлагаемый способ позволяет дифференцировать легкую, среднюю и тяжелую гипоксии ткани, например мозга,а также по снижению содержания в ткани ГТФ позволяет диагностировать ги"поксию на более ранней стадии чем из-.вестные способы, используюцие в качестве раннего критерия гипоксии снижение АТФ,Способ позволяет оценить состояние энергетического обмена ткани и тяжесть гипоксических нарушений путем исследования всего трех показателей энергетического обмена.