Способ получения фосфодиэстеразы

иня,. Э. П. Сийгур, Ю. саар, В. Э. Зариня, И изводственное объедин имической и биологиче завод органического с Института химии АН Эс 2) Авторы изобретен А. А, Мие Э.Э. Аави Научно-пр Институт и Опытный актив"Эстрад кой ССРФ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗ кость подвергают гельфильтрации на сефадексе Г, полученный раствор концентрируют ультрафильтрацией, ультрафильтрированный раствор хрома- тографируют на колонке с карбоксиметилцеллюлозой и элюируют раствором уксуснокислого аммония, причем удел ную электропроводность элюэнта беру в градиенте от (1.7-1,9) 10 Б с до (63-65)1 О 8 см-.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония, центрифугируют, осадок выбрасывают, надосадоч- ную жидкость используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят с раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью (15- 16) 10 ф Я см ", полученные фракции экзонуклеаэ с приблизительно одинаковым молекулярным весом обессоливают до удельньй электропроводности раствора (1,7-1,9) .10 Б см-" и конь.тм Изобретение относится к химико- фармацевтической промышленности.Известен способ получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюр зы, центрифугирования, хроматографического разделения с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования 1 .Однако этот способ не обеспечивает высокой активности и степени чистоты препарата (степень очистки 2-3 раза, содержащие эндонуклеазы5 ЕА/мг).Цель изобретения - повышение ак:тивности и степени чистоты.Цель достигается тем, что согласно способу получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центри фугирования, хроматографического раз деления с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования, растворение яда проводят в раст воре уксуснокислого аммония, после центрифугирования надосадочную жидР Сий 3 ур -А 6 Тар А. Вша: н;,А,А А1 Р3 942 центрируют с помощью ультрафильтрации. Полученную смесь наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой при линейном градиенте элюирования от удельной электропроводности раствора уксуснокислого аммония (1,7-1,9) х х 10 ЗБ см-" до (63-65).10Б см-" при постоянной рН среды, получают три белковых пика, фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют(11 пик) и высушивают лиофильно, Степень очистки 25-30 раз; активность фосфодиэстеразы 0,32-0,4 ед/мг; примесь эндонуклеазы (рибонуклеазы) отсутствует; примесь 5 -нуклеотидазы менее 2,8 10 ед/мг; примесь неспецифической Фосфомоноэстеразы менее 4,5 10ед/мг.П р и м е р 1. К 4,8 г яда гюрзы добавляют 50 мл раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроф водностью 15,3 10Я см , смесь медленно перемешивают в течение 30 мин при 4 С, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель- Фильтрации. На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15.3 .10смколонку с сефадексом Гсверхтонким (размеры колонки 4,2 х 140 см) наносят раствор яда,759 Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,3 10-Я см-" со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 15 мл, Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорда", Получают 9 белковых пиков. В 1 и 11 пике фракции, которые имеют Фосфодиэстеразную активность, объединяют (объем 200 мл) и ультрафильтрируют до выхода 20 мл нуклеазногс раствора с удельной электропроводностью 1,7 1 ОБ см "; доводят рН 10-ной уксусной кислотой до рН 5,5.Ультрафильтрированный раствор наносят на уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность раствора 1,7 х х 10 Я см ) колонку карбоксиметилцеллюлозы КМ. Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония рН 5,5 (удельная электропроводность раствора 1,7 10 5 см ) и начинают градиентное элюирование при постоянном рН 5,5, линейно увеличивая удельную электропроводность от 1,7 1 О Ы см " (количество раст 4вора 1 л) до 63 10 Э 5 см(количество раствора 1 л).Скорость элюации 45 мл/ч, собираются фракции по 15 мл. Оптическую плот 5 ность элюата регистрируют непрерывнос помощью "Увикорда". Во фракцияхопределяют фосфодиэстеразную активность (субстрат Са соль-бис-пара-нитрофенилфосфата).1 о При ионообменной хроматографиина КИ-целлюлозе получают три белковых пика (11 пик содержит Фосфодиэстеразу).Фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют (11 пик выход 170 мл)и высушивают лиофильно.Выход лиофилизированного препарата31 мг; степень очистки 30 раз; примесьэндонуклеазы отсутствует; активностьфосфодиэстеразы 0,39 ед/мг препарата;примеси 5-нуклеотидазы 2,6 .10 ед/мгпримеси неспецифической Фосфомоноэстеразы 2,910 5 ед/мг препарата; содержание белка 793.25 П р и м е р 2. К 5,0 г яда гюрзы добавляют 50 мл раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 16,010Б см , смесьмедленно перемешивают в течение 4 ч,зО Растворенный яд центрифугируют при5000 об/мин в течение 30 мин при 4 ОС.Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации,На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15,9-10 з Я см ".) колонку ссефадексом Гсверхтонким с размеромколонки 4,2 х 140 см наносят растворяда.Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 16 108 см " со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по15 мл,Содержание белка во фракциях Епределяют по экстинкции раствора при280 нм на спектрофотометре Сфв прямоугольных кюветах толщиной 1 см. Посодержанию белка во Фракциях рисуют50хроматограмму, получают 9 белковыхпиков. В 1 и П пике фракции, имеющиефосфодиэстеразную активность, объединяют (объем 210 мл) и ультрафильтруют до концентрации 20 мл и удельнойэлектропроводности раствора 1,89 х55х 10 5 см ". Доводят рН уксуснойкислоты до 55Ультрафильтрированный раствор на-носят на уравновешенную растворомформула изобретения Тираж 711 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. ПроектнаяМ 5 9127уксуснокислого аммония (удельная электропроводность раствора 1,9 10 З 5 смколонку карбоксиметилцеллюлозы КИ.Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония (рН 5,5,удельная электропроводность 1,9 хх 10Б см-") и начинают градиентное элюирование при постоянном рН 5,5,линейно увеличивая удельную электропроводность от 1,9 105 см(ко оличество раствора 1 л) до 6510 5 см "(количество раствора 1 л).Скоростью. элюции ч 5 мл/ч собираютфракции по 15 мл. Оптическую плотность определяют в каждой фракции, зВо фракциях определяют фосфодиэстеразную активность (субстрат Са соль бис-пара-нитрофенилфосфат),Фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют, выход 180 мл и высушивают лиофильно.Выход лиофилизованного препаратаЬО мг; степень очистки 25 раз; примесь эндонуклеазы отсутствует; активность Фосфодиэстеразы 0,31 ед/мг; ак дтивность неспецифической фосфомоноэстеразы 2,.6 .10 ед/мг; содержаниебелка 95 Ф.Лиофилизированный ферментный препарат полностью сохраняет активностьв течение 6 мес при хранении приОпределение активностей ферментов.Активность фермента Фосфодиэстеразы определяют с бис-п-.нитрофенилфосФатом кальция, который расщепляетсяпод действием фермента с образованием п -нитрофенола, За единицу актив,ности фосфодиэстеразы принимают количество Фермента, которое освобождаетмкмоль -нитрофенола в 1 мин при25 оАктивность 5-нуклеотидазы примеси в препарате фосфодиэстеразы определяют по количеству неорганического 4фосфора, который образуется при расщеплении ферментом 5 -АМФ.За единицу активности 5-нуклеотидазы принимают количество фермента,который отщепляет 1.мкмоль неорганического фосфора за 1 мин при 25 ОС.Активность неспецифической щелочной фосфомоноэстеразы определяют сп-нитрофенилфосфатом, который,поддействием фермента расщепляетдя с55ВНИИПИ Заказ 436/8 59 6образованием и-нитрофенола. За единицу активности неспецифической щелочной фосфомоноэстеразы принимают количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль и -нитрофенола в 1 мин при 25 С.Активность фосфодиэстеразы и ферментов примесей выражают на содержа- ние белка в препарате, которое определяется по методу Лоури. Рибонуклеазную активность определяют по гидролизу рибонуклеиновой кислоты. За единицу активности принимают количество Фермента, вызывающее нарастание В 2 на 0,1 в течение 10 мин при 25 ОС.Технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в экономии змеиного яда за счет увеличивания качества ферментного,препарата (увеличивание удельной активности, не содержит примеси других белков). Высокие показатели чистоты являются предпосылкой практического использования фосфодиэстеразы. Способ получения Фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центрифугирования, хроматографического разделения с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности и степени чистоты, растворение яда проводят в растворе уксуснокислого аммония, после центрифугирования надосадочную жидкость подвергают гель- фильтрации на сефадексе Г, полученный раствор концентрируют ультра- фильтрацией, ультрафильтрированный раствор хроматографируют на колонке с карбоксиметилцеллюлозой и элюируют раствором уксуснокислого аммония, причем удельную.электропроводность элюэнта берут в градиенте от (1,7-1,9) х х 10Я см-"до (63-65) 10 Я см и,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Розенталь Г. ф. и др. Изв. АНЛатвийской ССР, сер. "Химия", 1970,Я 5, с.623.