Способ определения фертильности пыльцы цветковых растений

) УДК 631.52: :581;6(088,8) иа Йвлзм вм 1 рРивы и ОтВьпнй(71) Заявитель скохозяйственный инстит евскин 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ фЕРТИЛ ЦВЕТКОВЫХ РАСТЕНИЙТИ ПЫЛЬЦЬ Изобретение относ я к селекции ибыть использовано може йстве еменоводству сельском хоз Известны с ябопределения фертильающие проращиваниен-Тигена с использовенной среды или испольба В,С. Ц.ардакова путем зидила на живую пыльцу, оксидазу 1 . ности, предусма пыльцы в камер ванием искусст зование спосо воздействия бен содержащую пер 5 Однако известности пыльцы неанализ в полевыхдк ости использрудования, а тазатрат времени,вается на качест е о еделения фертильют проводить х из-за необхоециального обо 15ют значительных ицательно сказыы и искажает услов ования с кже треб что отр ве пыль ия 20 льцы м, что т по на- фермента получаемые результаты,Известен также способ оЬр неспособности и фертильност П, И. Днако, заключающийся о жизнеспособности пыльцы личию активного дыхательно сукциндегидразы, в присутствии которого бесцветный раствор 2, 3, 5 - трифенилтетразол хлористый в 1 /1 5 М фосфатном буфере Серенсена с рН 7,17 восстанавливается в формазан ярко-красного цвета. Погибшие пыльцевые клетки остаются бесцветными 21.Недостатком известного способа является то, что степень окраски пыльцевых зерен в красный цвет осуществляется визуально, что не позволяет различить категории полустерильных и полуфертильных пыльцевых зерен, кроме того, дыхатель ный фермент сукциндегидраза, дающий ярко-красное окрашивание, выделяется из пыльцевого зерна в окружающую среду, что дает ярко-красное окрашивание этого раствора, маскирующего истинный цвет пыльцевых зерен.Цель изобретения - получение более точных результатов за счет быстрой и длительно сохраняемой фиксации.Поставленная цель достигается тем, что в смесь 0,5-1,0 Ъ-ного раствораИ)6456 з2, 3, 5-трифенилтетразсда хлористого и 1/15 М фосфатного буфета Серенсена,1 рН 7,17 вводят 1,0-1,3%-ный раствор йод-калий-йод, полученную массу микро- скопируют и по окраске пыльцы судят об ее фертильности,1-3% ный раствор йод-калий-йод готовят из расчета 1-3 г металлического йода в растворе 2 г калий-йод и 297 г дистиллирсванной воды (по Грамму), К фертЮдьным пальцевым зернам относят зерна черно-фиолетовой окраски, к полуфертильным - зерна, одна клетка которых черно-фиолетовой окраски, а другая- розово-оранжевой, к полустерильнымзерна с серо-фиолетовой окраской и к стериальным - зерна белые или яркожелтые. Собранную в поле пыльцу наносят тон 20кой кисточкой на предметное стекло ираспределяют тонким слоем на плошадив 1 см, капают на пыльцу 1 каплю 0,51,0%-ного раствора 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1 /1 5 М фосфатномбуфере Серенсена, рН 7,17, тшательносмешивают до получения однородной массы, которая сразу розовеет от выделяющегося фермента сукциндегидразы, Затемслегка смоченной в 1,0-3,0 /о-ном растворе З 0йод-калий-йода стеклянной палочкой еше разтщательно перемешивают массу пыльцы, которая в результате приобретает темную окраску и хорошо различима в розовой жидкости,Для микроскопирования с помощью мик 35роскопа МБС 1 или МБСв поле илив помещении полученную смесь пыльцы иреактивов покрывают покровным стекломс нанесенной заранее сеткой. Размер сеткц 10 х 1 0 мм, причем при подсчете фертильных и стерильных пылинок просматривают 5 вертикальных рядов сетки, считая через ряд (10 ячеек х рядов = 50ячеек-квадратов),Под влиянием использования в реакдии двух перечисленных реактивов пыль цевые зерна и окружаюший раствор снацала становятся розовыми, затем оранжевыми, потом Фертильные зерна приобретают черно-фиолетовый цвет (от взаимо- децствия Йода и крахмала), а светлая половина фертильных пыльцевых зерен становится оранжевой или абрикосов- розовой,Весь процесс анализа пыльцы от мо мента ее взятия до окончания микроскопцрования занимает 5-1 0 мин. 4Прц необходимости вывоза пыльцы споля дця анализа в пабораторци данныйспособ обеспечивает фиксирование засчет йод-калий-Йода истинного количествафертильных пыпьцевых зерен. Окраска,вызванная последовательным действиемреактивов, обеспечивает устойчивый цвет,сохраняющийся на протяжении не менеешести месяцев без изменения. При длительном хранении окрашенной пыпьцы, ееследует поместить на предметное стекпос выемкой дпя "висячей каппи", обработать реактивами согпасно данному способу, покрыть покровным стекпом и хранить даже в высохшем состоянйи, Приступая к подсчету процента фертильныхпыльцевых зерен, необходимо добавитьк пыдьце одну каплю дистипдированнойили кипяченой воды. Подсчет производится на покрывном стекле по указаннойметодике,П р и м е р 1, Обработку производят следующим образом: пыльцу кукурузы генотипов юР -9 и Днаносят тонким слоем на предметное стекло кисточкой на плошади 0,5 см. Затем капельнтьцей наносят одну каплю 0,5/о-ного раствора 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1/1 5 М фосфатном буфере Серенсена, рН 7,17 и препаровальной иглой тшатель. но смешивают с пыльцой. В течение 3 мин проходит реакция в данной смеси, и под влиянием дыхательного фермента пыльцы ее живые клетки и окружаюший раствор окрасились в розовый цвет одной интенсивности, Затем стеклянную палочку окунают в 1,0 Ъ-ный раствор йод-калий- йода, стряхивают каплю в сторону и мок. рую палочку вводят в смесь пыпьцы и описанного раствора, тщательно перемешав смесь. В резупьтате раствор в смеси приобретает абрикосово-оранжевый цвет, а пыльцевые зерна потемнеют, что видно невооруженным глазом, Под стереоскопическим микроскопом МБСвидно, что жидкость в капле смеси имеет абрикосово-оранжевую окраску, а пыльцевые зерна, отреагировав с йодом, получа ют разную окраску в зависимости от степени фертильности, а именно: фертильные зерна становятся черно-фиолетовыми, полуфертильные имеют половину (одну клет" ку пыльцевого зерна) черно-фиолетовую, а вторую половину ( вторую клетку пыль девого зерна) розово-оранжевую, полусте рипьные пыльцевые зерна равномерно или однобоко серо-фиолетовые или серо-корич. неватые, стерипьн 1 не - белые или ярко5 .оси жолтые в зависимости от отсутствия нпн наличия органических вел зета. При помощи сеточки на покровном стекле подсчитывают процент фертильности пыльн. Весь процесс обработки пробы пыльцы занял 5 мин и проверялся десятикратно на свежесобранной пыльце, Проверка показала, что после описанной обработки пыльца не изменяла окраски в течение более полугода, Это дает возможность долгое время подсчитывать процент фертильных и стерильных зерен в процессе их хранения взакрытой склянке в холодильнике при температуре +2 д С.П р и м е р 2. Берут 0,75%-ный раствор 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого и 2,0%-ный раствор йод-калий-йод, Последовательность обработки пыльцы была та усе, На предметное стекло на . плошадь 0,5 см наносят тонкий слой пыльцы. Сверху наносят одну каплю 0,75%- ного трифенилтетраэола хлористого в 1/15 М фосфатном буфере Серенсена, рН 7,17, тщательно перемешивают. Возникла интенсивно розовая окраска пыльцы и 2 раствора, Через 2 мин вводят в смесь стеклянную палочку, смоченную 2,0%-ным йод-калий-йод, тщательно перемешали. Немедленно возникла дифференцированная окраска - раствор стал розово-оранжевым ЗО а пыльцевые зерна от черных до розовато- оранжевых и белых. Под микроскопом при увеличении объектива х 4, окуляра х 7, с помощью сеточки, нанесенной тушью на покровное стекло, проводят подсчет количества черно-фиолетовых фертильных, наполовину фиолетовых наполовину оранжевых полуфертильных, белых или желтых стерильных пыльцевых зеренПодсчет проводят по 50 ячеям-квадратам сеточки на стекле. Данный пример показал, что дифференцированная окраска пыльцы сохранялась более полугода.П р и м е р 3. В данном случае используют 1,0%-ный раствор 2, 3, 5-трифенилтетразола хлористого в 1 /1 5 М фоофатном буфере Серенсена, рН 7,17 и 3,0%-ный раствор йод-калий-йод, Свеже- собранную пыльцу наносят кисточкой на Г( опро;э тнткл., лерку капают 1,0% н 11 Й раствор трифеннлтетразоле, размеши веют пречаровальной иглой н тут же вводят стеклянную палочку, смоченную 3,0%- ным йод-калий-йод, перемешивают смесь, Немедленно возникает интенсивная окраске растворе от малиново-розового до розово-оранжевого цвете и темная черно- фиолетовая, серая н белая окраска пыльцевых зерен, заметных невооруженным глазом, Предметное стекло прчкрывают цокровным с нанесенной на него тушью сеточкой. Приготовленный препарат транспортируется в лабораторию и затем микроскопируется, как в примерах 1 и 2, Дифференцированная окраска пыльцевых зерен сохраняется в течение полугода.Проверка показала, что по известному способу (Диакону) при увеличении срока хранения процент фертильности пыльцы понижается. Так, например, через 2 ч после сброса пыльцы ее фертильность 70,1%, через 6 ч 59,2%, через 14 ч 43,2%, что явпяется результатом гибели пыльцы от высыхания,формула изобретенияСпособ определения фертнльности пыльцы цветковых растений путем воздейсчвня на нее 0,5-1,07 ным раствором "2,3, 5-трифенилтетрезола хлористого в1/1 5 М фосфатном буфере Серенсена,рН 7 17, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью получения более точных результатов за счет быстрой и длительносохраняемой фиксации, в полученную смесьвводят 1,3-3,0%-ный раствор йод-калийЙод, после чего полученную массу микроскопируют и цо окраске пыльцевых зеренсудят об их фертильности,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений. М., Колос", 1974,с. 215-224.2, Там же, с. 219 (прототип),Составитель М, ДранишниковТех ед Л. ПекарьРедакто С. Пат ушева Кор екто Е. Рошко Заказ 431/3 Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Тираж 698 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб, д, 4/5