Способ получения рибосомальной рибонуклеиновой кислоты

(и)904708 Союз СоввтсинкСоциалиетичееиикРеспублик ОЛ ИСАЙИ ЕИ ЗОБ РЕТЕ Н ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(5)М. Кл. с присоединением заявки рй А 61 К 35/60 Ркударетаицак кенктет СССР ао делам кзебретеикк и открыткаОпубликовано 1 5, 02 . 82. Бюллетень ,В 6 Дата опубликования описания 1 5 . 02 . 82(72) Авторы изобретения Н.Л.Делоне и А,Г,Хволес Второй московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И.Пирбгова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОСОМАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫИзобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения ДНК в экспериментальной практике.Известен способ получения рибо"5 сомальной рибонуклеиновой кислоты путем гомогенизации овоцитов рыб раствором хлористого натрия, обработки клеточной суспензии фенолом, суспендирования в смеси хлористого натрия-фенол-додецил-сульфата натрия, обработки этанолом и центрифугирования 1 Ц .Однако известный способ не позволяет увеличить выход целевого продукта.Эта цель достигается тем, что способ получения рибосомальной рибонуклеиновой кислоты осуществляют путем гомогенизации овоцитов рыб раствором хлористого натрия, обработки клеточной суспензии фенолом, суспендирования в смеси хлористого натрия и фенол-додецил-сульфата натрия,обработки этанолом и центрифугирования, овоциты рыб перед гомогенизацией помещают в воду, добавляют диметилсульфат в концентрации 310 М .310М и выдерживают их в течение 4-6 ч.Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1. В 1 л отстойной воды водопровода с десятью вьюнами (самки) добавляли диметилсульфат (ДМС) в концентрации Зе 10 М, после воздействия которого наблюдается полная гибель рыб через 1 ч от начала его применения. При гистохимическом и биохимическом анализах овоцитов в опыте, а также в контроде .1 О вьюнов - самок) у рыб никаких изменений в отношении содержания РНК в овоцитах не отмечалось.П р и м е р 2. В 1 л отстойной воды водопровода с десятью вьюнами (самки) дзобавляли ДМС в концентрации 310 М. Рыб через 6 ч забивают4708 . 4В опыте: 45 Я нет; 28 Я 4,8 У;18 Я 7,1; 5 820,5,В контроле: 28 Я - 3,9 У; 18 Б -7,2 Ч; 5 Я - 22,1,Сопоставление использованных способов показывает, что действие диметилсульфата на опытных вьюнах (пример 2) приводит к усилению синтетических процессов. Диме гилсульфатО стимулирует появление в клетке овоцитов вьюна всех фракций рибосомальной РНК, включая предшественник(45 Б РНК).Регуляция считываия совсех этих генов связана, В нормебольшое число рибосомальных геновзаблокировано. Ряд районов ядрышкового организма при этом гетерохроматизируется. Диметилсульфат снимает блок гетерохроматина с этих участ 2 О. ков. Происходит одновременная регуляция генов и рибосомальной РНК игенов, с которых идет считывание 5 БРНК.Предложенный способ позволяет резко увеличить содержание всех фракцийРНК в анализируемом материале (овоциты вьюна). Содержание всех исследуемых Фракций РНК по сравнению с контролем увеличивается: 28 Я -в 5, 1 раза;18 Б - в 4,3 раза; 5 Я - в 3,07 раза.После воздействия диметилсульфатав овоцитах вьюна обнаружается Фракция 45 Я РНК, равная 10,4 У РНК, в то время, как в контрольных овоцитах Предлагаемый способ получения рибосомальной Рибонуклеиновой кислоты отличается простотой и через 4- 6 ч позволяет увеличить все Фракции РНК в анализируемом материале. Способ может быть широко использован в практике лабораторных биохимических исследований,3 90и выделяют их яичники для гистохимицеских и биохимических исследований,Рыбы в контроле (1 О вьюнов-самок)были живы, никаких изменений в отношении содержания РНК в овоцитах не отмечалось.Биохимические исследования классов молекул рибосомальной РНК овоцитов опытных вьюнов показали, чтопри использовании метода электрофореэа в геле агарозы в опыте можновыявить полосы электрофореза, соответствующие 45 Б РНК, 28 Б РНК, 18 ЯРНК, а также 5 Я РНК, а в контрольном геле полоса класса 45 Я РНК отсутствовала. Кроме того, при последующих расчетах площадей на графикахсканирования в спектрофотометре с оптической приставкой для цилиндрических гелей при изучении каждого класса рибосомальной РНК было показана,что участки геля опыта с полосами 28 ЯРНК, 18 Б РН, а также 5 Б РНК намногопревышают соответствующие участки вконтрольном геле. В цифровых показателях это можно представить следующим образом.В опыт: 45 Б - 0,4 т; 28 Я -21,5; 18 Я - 31,6; 5 Б - 70,4 Ч.В контроле 28 Б - 4,2% 18 Я 7,3 В 5 Я - 239.Используя метод биохимическогоанализа, получают распределение РНК,свидетельствующее о повышении содержания в опыте всех классов рибосомаль . она отсутствовала.ных РНК. Кроме того, появился пока 35эатель, регистрирующий присутствие45 Б РНК в опыте, Выход РНК по сравнению с контролем увеличился по фракциям: 28 Б - в 5,1 Й 11,9 М, 18 Я -в 4,3 (335,61), 5 Я - в 3,07(206,08 Ц раза,В.контрольном геле Фракция 45 ЯРНК отсутствовала, а в опыте она содержала 10,4РНК.45П р и м е р 3. В 1 л,отстойной воды водопровода с десятью вьюнами (самки) добавляли ДМС в кнцентра" ции 3 "ИГ М воздействие которогосовершенно не отразилось на состоянии рыб. Рыбы в контроле (1 О вьюнов- самок) были живы, никаких изменений в отношении содержания РНК в овоцитах не отмечалось. Выход РНК по Фракциям существенно не отличался в геае опыта от геля контроля я может быть представлен следующими цифровыми показателями. Формула изобретения Способ получения рибосомальной рибонуклеиновой кислоты путем гомогенизации овоцятов рыб раствором хлористого натрия, обработки клеточной суспензии Фенолом, суспендирования в смеси хлористого натрия и фенол-додецил-сульфата натрия, обработки этанолом и центрифугирования, отличающийся тем, что; с целью повышения выхода целевого продукта, овоциты рыб перед гомогеЗаказ 195/Э Тираж 716 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5низацией помещают в воду, добавляют диметилсульфат в концентрации от 3 10М до 310 " М и выдерживают их в течение 4-6 ч. Ь Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР М 639897, кл, С 07 Г Ъ 1/00, 1977.