Способ получения бактериальногоферментного препарата мацерирующегодействия

Союз Советскик Социалистических Республик(51)М, Клз С 12 М 9/06 с присоединением заявки Йо -Государственный комитет СССР по деаам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Г, Б. Бравова, В. И. Дуда, К. А. КалунВ. В. Сакович, М. В, Самойлова, А. М. Ж" тГ: - Козловау-"иро.Д:;Щ, ,",Д. "ижевцов 13 , . 3 хни Ыйий ййстситут ный ЩЩйввэ цуА Всесоюзный научно-исследовательский би Институт микробиологии АН СССР и Центрисследовательский институт лубяных(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА МАЦЕРИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ Изобретение относится к микробно- ределяется прямым спектрометрированилогической промышленности, производя- ем при длине волны 235 нм, щей бактериальные и ферментные препа- к недостаткам способа относится раты, и может быть использовано в про- большая продолжительность культивимышленности гервичной обработки лубо рования продуцента, а также наличие волокнистых культур и сельском хозяй- целлюлозы в Ферментативном комплексе стве для облагораживания грубых кор- препарата, что значительно снижает мов. о крепость технологического льноволокИзвестен способ получения фермент- на при применении препарата в промвш ных препаратов с высоким содержанием О ленности первичной обработки льна, транс-элиминазы пектиновой кислоты, Известен также способ получения обладающих повьваенной способностью к пектолитичеекого,ферментного препадеструкции растительных материалов 11 Рата с 21для получения этих препаратов про- Дляполучения ферментного препараеодят культивирование Вас 111 цв ро 11- 15 та культивируют анаэробный микроорга- еуха при 28 оС в течение 7-50 ч в за- ним С 1 овсг 141 ов Уе 1 в 1 пеов 22 при висимости от емкости реакционного со С в течение 48 ч на среде, содерсуда РН питательной среды, перед за- жащей в качестве источника углерода севом доводят до значения 6,5-7,0, . декстинКультуру выращивают в колбахЭрлен К недостаткам способа относятся мейера на качалках при 200 об/мин . высокая стоимость и дефицитность ис или в ферментерах с режимом аэрации точника углерода в питательной сре.0,5-0,85 (объем воздуха/объем среды де, а также значительная продолжив мин). Активность трансэлиминазы тельность процесса культивирования пектовой кислоты в культуральной жид 25 продуцентакости 1500-4500 ед/мл (эа е 4 иницу Наиболее близким к предлагаемому активности фермента принимается та- способ получения бактериального феркое его количество, которое вызывает ментного препарата мацерирующего в условиях реакции увеличение экстинк- действия предусматривает. выращивание ции на О, 1 за 10 мин), Активность оп анаэробной культуры С 1 о с г 1 д 1 ив ресс 1,по 1 егаепапь 15 при 30 С в течение чается мешалка при низких числах обоЗбч с дальнейшей Фильтрацией рртов. Выращивается продуцент при культуррьной жидкости на барабанном температуре 37-42 С в течение 20 - вакуум-Фильтре с применением микрози ч. К этому времени заканчивается ла, упариванием в вакууме и концент- логарифмическая стадия равития кульрированием методом осаждения ацето- туры и в культуральной жидкости ианом или распылительным высушиванием5капливается максимальное количество на сушилке типа го Айоаег, Пек- ферментов, отвечающих за мацерацию тин-транс-элиминазную активность оп- растительной ткани. По окончании проределяли по увеличению оптической цесса выращивания культуральную жидплотности при длине волны 235 нм. 1 екость фильтруют на барабанном вакуумПри этом за единицу активности фер- фильтре с применением перлита, конмента принималось такое его коли- центрируют на вакуум-выпарной устачество, которое вызывало увеличение новке при 30 С до содержания сухихоооптической плотности на 0,555 за 1 ч веществ 12 Е, затем в концентрат дов условиях реакции. К концу культи- бавляют 0,1 СаС и 12 ИаС и сушат вирования в культуральной жидкости 5 на распылйтельной сушилке при следуо накапливалось О,б ед/мл пектин-транс- ющем режиме: Т= 130-135 С, Те, -элиминаэы, Для удаления воздуха при = бО-б 5 С.выращивании строго анаэробного продуцента СоврагцРесапоегвеосагз . П Р и м е р 1, ВасЦь с гсца 1 ь 15 питательнУю среду после стерили З 1 выращиэают в Ферментере емкостью зации дополнительно выдерживают при 250 л., Объем питательной среды С в течение 30 мин. После этого 100 л, ее состав в процентах следую- среду быстро охлаждают и засевают . щий: свекловичный жом - 2; СаСОз посевным материалом. Затем добавля,5. (Н 4) НРО - 0,75; КЙРО - О, 1; ют стерильную смесь параФина и вазе- р кукурузный экстракт - 0,5. Питательлина (1:1) для образования пленки, ную среду стерилизуют при 1 ати в тезащищающей культуральную жидкость от чение 1 ч, Затем среду охлаждают до воздуха незаполненной части Фермен С, значение РН доводят до 8,0 стетера. Все операции по передавливанию рильным раствором концентрированной компонентов питательной среды в фер" 30 щелочи и засевают посевным материаментер и охлаждению ее после стерн- лом в количестве 5. Культивируют лизации производятся стерильным инерт- продуцент при температуре 37 С в теным газом, что позволяет избежать кон- чение 24 ч без подачи воздуха. В такта с кислородом воздуха Все меры культуральной жидкости по окончании по созданию строго анаэробных Усло- процесса культивирования определяютвий культивирования продуцента Услож" ся активности следующих ферментов:35няют технологию и повьыают стоимост пектин-транс-элиминазы прямое спектконечноГо продукта. Кроме того, в фер рофотометрирование по длине волны ментативном комплексЕ препарата, полу 235 нм; за единицу активности приниченного данным способом, отсутствую мается такое количество фермента, гидролитические и лиазные ферменты 46 которое катализирует расщепление эндо-действия, активность пектин- субстрата до образования 1 ммоля -транс-элиминазы недостаточно. высока дигалактуроновой кислоты. Коэффициентмолярной экстинкции принимается равцель изобретения -повышение ак- ным 4800 моль " см"), эндо-полигалак" тивности пектин-транс-элимнназы и Растуроназы (вискозиметрическим методом) ширение ферментативного комплекса экзо-полигалактуроназы (по увеличепрепарата. нию количества восстанавливающихальдегидных групп титрометрическимПоставленная цель достигается тем, методом). Опре еленке активностей что в качестве продуцента используют 0 ферментов в культуральной,жидкости факультативно-анаэробный микроорга- дало следующее результаты, ед/мл низм Вас 1 ь сгс 0 аоь В 31, а выра- Пектин-транс-элиминазы 1,5 щивание проводят в течение 20-24 ч Эндо-полигалактуроназа 1,5 при температуре 37-42 С, причем РНоЭкзо-полигалактуроназа: 3,4 питательной среды перед посевом до- Культуральную жидкость подают на водится до 8,0-8,4. ИФильтрацию для отделения биомассыПредлагаемый способ осуществляет- и нерастворимых остатков питательной ся следующим обРазом. среды. ильтрат культуральной жидкос"РПитательная среда стерилизуется ти концентрируют при 30 С на вакуумпри 1 ати в течение 1. ч, охлаждается выпарной установке до содержания судо 50 С, значение РН доводится до 0 хих веществ 11,5 фБ. К концентрату до,0-8,4 стерильным раствором концент- бавляют 0,1 СаС) и 11,5 МаС и рированной щелочи и засевается посев- высушйвают на распылительной сушилке. ным материалом в количестве 5, Для Выход Ферментного препарата Мацеробаравномерного распределения культуры циллин ГЗх составляет 4 кг со 100 л четыре раза в сутки на 3-5 мин вклю культуральной жидкости.817052 Составитель Т. ТуляковаРедактор И, Лысогорова Техред Н.Келушак Корректор М. Демчик Заказ 1232/32 Тираж 528 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауыская наб., д. 4/5Филиал ППП фПатент"г, Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р 2. Вас 111 цв с 1 гсц 1 апв 31 выращивают в 3-х литровых колбах. Состав питательной среды и режим стерилизации те же, что и в примере 1. рН после стерилизации доводят до значения 8,2 и засевают посевным материалом в количестве 5. Выращивают продуцент при 40 С в течение 22 ч. В культуральной жидкости определяют активности ферментов, ед/мл:.Пектин-транс-элиминаза 2,0 . Эндо-пйтигалактуроназа 2,3 Экзо-полигалактуронаэа 3,8 П ри м е р 3, 8 ас 111 цв сгсц 1 апв 31 выращивают в 3-х литровых колбах Состав питательной среды и режим стерилизации те же, что и в примере 1. рН после стерилизации доводят до значения 8,4 и засевают посевным материалом в количестве 5. Культивирование проводят при температуре 42 оС в течение 20 ч. В культуральной жидкости определяют активности Ферментов, ед/мл:Пектин-транс-элиминаза 1,7 Эндо-полигалактуроназа 1,8 Экзо-полигалактуроназа 3,2Формула изобретенияСпособ получения бактериального ферментного препарата мацерирующего.действия, заключающийся в выращивании продуцента глубинным методом,фильтрации .культуральной жидкостии распылительном высушивании сконцентрированного Фильтрата культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью повыаения активности пектин-транс-элиминазы ирасюиренкяФерментативного комплек-са препарата, в качестве продуцента используют факультативно-анаэробф ный микроорганизм 8 ас 111 цв с 1 гсц 1 апвВ 31, а выращивание проводят в течение 20-24 ч при температуре 37-42 С,причем рН питательной среды передпосевом доводят до значения 8,0-8,413Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Заявка ФРГ В 2054948, 1973.2. Авторское свидетельство СССР;щ В .622838, 1978. 3. Бравова Г. Б. и др, Технологиякультивирования анаэробных бактерийрода С 1 овйг 1 д 1 цв - продуцентов пектолитических ферментных препаратов.2 Сб. Ферменты. Получение и применениев народном хозяйстве", ТрудыВНИИсинтезбелок Вып., 2, М., 1974,