Способ измерения содержания мертвых клеток в дрожжевой суспензии

СОЮЗ СОВЕТСНИХСООИАЛЮВЕСИИИРЕСПУБЛИК ОЮ 01) 1511 С 12 1 б писдник изоврЕТЕНИя СТВУ. ГОСУДАРСТВЕННЬ 1 Й КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИЩЕ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ(54) (57) СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕРТВЫХ КЛЕТОК В ДРОЖЖЕВОЙСУСПЕНЗИИ методом световой микроскопии, отличающийся тем,что, с целью повышения точности искорости измерения; в отдельностидля каждой из клеток измеряют.распределение амплитудоптическойплотности с последующим определени ем частоты встречаемости каждой изних, ипо полученным частотам рас-считывают дисперсию и асимметрию,при зтом мертвые клетки идентифицируют ао пороговым значениям диспер". сии и асимметрии, рассчитаннымзаранее для каждой культуры микроорганизмов,Изобретение относится к микробиологйческой промышленности,При выращивании дрожжей .в проюпйенных условиях в раздел микробйологического контроля входит определение процентного содержаниямертвых клеток в дрожжевой суспен зии через" каждые два часа йэ"какдого ферментера., Известны способь 1 определения про Оцентного содержаййя мертвыхклетокпутем,прокрашивания их метиленовойсинью или синькой Лефллера и под счета отношений числа прокрашеннцх,клеток к общему числу просмотренныхклеток Я ."Недостаток известных способовзаключается в неустойчивости красителя., т.е. изменении его свойств.Наиболее близким к изобретению 2 О1По технической "сущности и достигаемому эффекту является способ измере ния:содержания мертвых клеток методом световой микроскопии 2, Способ.заключается в том, что в пробу дрожжевой суспензии, взятой из ферментера, добйвляется метиленовая сИнь.Препарат готовят таким образом, чтобы получилось монсслойное расположенйе дрожжевых клеток. Препаратайализируется в микроскопе в проходящем свете.Процентное Содержаниемертвыхклеток определяетсявизуально путем подсчета числа мертвых клетокиз рассмотренных ста дрожжевых З 5клеток. Мертвые клетки имеют темносинюю окраску, а живые - слабо-серую или серб-синюю окраску- взависимости от ослабленности клеток.Недостаток такого способа заключает О. ся в большой трудоемкости (времяанализа 40-60 мин), малой статйс тике (увеличение числа клеток боль"ше 100 значительно увеличивает тру доемкость измерений) субъективностй в оценке степени прокрашенностии нестабильности красителя в зависимьсти от времени .его храйения.Это приводит к тому, что коэффициентвариации, т.е. отношение средне"квадратического значения 6 к средне"му значениюсодержания мертвыхклеток определенныхизвеСтньмспособом но 20-30 полям зрения однойпробы составляет. 0,4-0,5, т.е. подсчет недостаточно точен (груб).Целью изобретения является уве= лйчеййе"точности и скорости измере.,1 Фнйя содержания мертвых клеток вдрожжевой суспензий.Поставленная цель достигаетсятем, что в отдельности для каждойиз клеток измеряют распределениеамплитуд оптической плотности с пос"ледующим определением частоты встречаемости каждой из них и по полученным частотам рассчитывают дисперсию и асимметрию. При этом мертвые клетки идентифицируют по пороговым значениям дисперсии и асимметрии, рассчитанным заранее для каждойкультуры микроорганизмов.Сущность способа заключается в том, что пробу дрожжевой суспензий, взятой из ферментера, помещают на предметное стекло и приготавливают препарат с монослойным расположением клеток. Препарат закрепляют настолике сканирующего микроскопа ипутем аноптральной микроскопии спомощью фотоумножителя определяютамплитуды оптической плотности длякаждой из клеток, По полученным амплитудам рассчитывают частоту встречаемости каждой из них и определяютфункцию распределения амплитуд оптической плотности для кащпой клетки. По функциираспределения вычисляют дисперсию и асимметрию известным способом. По значениям диспер-, сии и асимметрии всех просмотрен ных клеток определяют процентное содержание мертвых клеток, которыехарактеризуются определенными значениями дисперсии и асимметрии. Эти значения рассчитывают следующим образом, В поле зрения сканирующего светового микроскопа помещают отдельно только мертвые, а потом живые клетки и вычисляют для них значення асимметрии и дисперсии по частоте встречаемости амплитуд их оптической плотности. Таким путем доказано, что мертвые клетки имеютменьшие значения дисперсии по сравнению с живыми и отрицательные значения асимметрий в отличие от живых, для которых асимметрии положятельныП р и м е р, Из ферментера берутпробу дрожжевой суспензин с ку.ьтурой СапдЫа дид 11 егшопду и приготавливают препарат, который эакрепляют на столике сканирующего микроскопа, соединенного с вычислительной машиной, затем осуществляют поРедактор Л. Утехина Техред Л.Микеш Корректор С.Шекмар Подписное Заказ 8907/1 Тираж 521 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5й% Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3 7 строчное сканирование пробы с шагом 0,5 мкм и зондом 1 мкм. Фотоумножитель фиксирует в каждой точке отсчета амплитуду оптическойплотности . изображения дрожжевой суспензии в . аноптральном контрасте. Вычислитель-, ная машина рассчитывает асимметрию и дисперсию распределений амплитуд оптической плотности для каждой из1 клеток. Было принято, что если :асимметрия отрицательна.и .значение дисперсии меньше 12, то клетка считается мертвой. После анализа 100 клеток определяют отношение числа мертвых клеток к живым. Из 100 клеток.5 идентифицированы как мертвые.Ошибка измерения содержания мертвых клеток составляет 5-103 с коэффициентом вариации 0,1-0,2, тогда как в прототипе он .был равен 0,4- 0,5.В предлагаемом способе точность измерения повышается по сравнению 39898 4с прототипом за счет исключениякрасителя в методике приготовленияпрепарата, объективного и на большей,принадлежности дрожжевой клетки кмертвой или живой. Скорость измерения повышается за счет его полнойавтоматизации. Электромеханическоесканирование пробы занимает 5-10 мин.10Расчеты на ЭВМ "Днепр-" занимают еще 5-10 мин, а на ЭВМ М"1-2 мин. 1Благодаря этому становится возможным использовать измеряемый параметр для экспресс-контроля состояния дрожжевой культуры и как один из параметров для управления процессом биосинтеза в АСУ ТП, оснащенных современными УВМ, что позволит повысить производительность и качество биомассы,