Способ получения церулоплазмина

(51) 6 А 61 К 38 48 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИКГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СС(и) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ свидетельству вт 0 рс паратов. Цель изобретения - сокращение стадий. Сущность изобретения заключается могенизации П фракции по Кону отходов про дства гамма-глобулина в растворе хлористо трия, сорбции полученного гомогената на целлюлозе, активизированной ионизирующим чением, элюции 025 М раствором хлористо трия, осаждении примесей смесью этилового та с хлороформом, центрифугировании, оса из надосадочной жидкости целевого продукт ловым спиртом, растворении осадка, его ст зующей фильтрации и лиофилизации. П тельный эффект заключается в сокращении этапа осаждения спиртом и растворения оса 25м онкологии им.Р.Е.КавецкогБасова Р.В; Гавриш И.Н.; КоМокроусова ЛА; Напалков ССР М 1607197, кл. ЕРУЛОПЛАЗМИельств ЕНИЯ тся к мефермента жет быть ских презобретение относ нологии получения рулоплазмина, и м изводстле медици(57) Использование:дицине, а именно к текрови человека - цеиспользовано при про числа В ГО- ИЗВОГО НдДЭАЭ -излу- ГО Нд- спирждении а эти- ерили- ложи- ОДНОГО дкаИзобретение относится к технологииполучения фермента крови человека - церулоплазмина и может быть использовано припроизводстве медицинских препаратов,Целью изобретения является сокращение числа стадий,Поставленная цель достигается путемиспользования в качестве сорбвнта активированной целлюлозы отечественного производства, которая позволяет осуществлятьсорбцию и элюцию препарата без применения хроматографических колонок, что, с одной стороны, значительно упрощаетпроцесс и сокращает время элюирования, ас другой - исключает потери сорбента приэлюировании и регенерации,Кроме того, применение указанногосорбента позволяет исключить из технологии стадию промежуточного осаждения церулоплазмина спиртом из элюата иокончательную очистку препарата осуществлять непосредственно после элюции 0,25М раствором хлористого натрия.Сущность изобретения заключается вследующемОтходы производства гамма-глобулина(фракции бета-глобулинов сыворотки крови)гомогенизируют в 0,05 М раствора хлористого натрия), сорбируют церулоплазмин изполученного гомогената на активированнойДЕАЕ-целлюлозе при рН 6,3, освобождаются от балластных белков. промывая сорбент0,12 М раствором хлористого натрия, элюируют церулоплазмин, помещая сорбент всосуд с 0,25 М раствором хлористого натрия(при соотношении сорбента и элюата 2:1),доводят рН элюата до 5,2, температуру до25 С, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации соответственно 25 об,;6, образовавшийся осадокотделяют центрифугированием, доводятконцентрацию спирта в центрифугате до 55об.;4, выдерживают на холоду 10 ч при минус10 С, центрифугируют, осадок препаратаподвергают растворению, стерилизующейфильтрации и лиофилизации,П р и м е р 1. 3 кг осадка 11 фракции поКону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 14 л охлажденного до 4 С 0,05 Мраствора хлористого натрия, доводят рН гомогената до 6,3, в полученную суспензиюдобавляют 300 г активированной ДЭАЭцеллюлозы. Смесь оставляют при слабомперемешивании на 18 ч при 4 С, ЦеллюлозуС сорбированным церулоплазмином отмывают от неспецифических белков в мешке изх/б ткани, помещая ее в сосуд с 5 л охлажденного до 4 С 0,12 М раствора хлористого. натрия (последнюю процедуру проводяттрижды до оптической плотности отмыв 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 шейся от сорбента суспензии балластных белков при длине волны 280 нм (Е 280) равной 0,100). Отмытую ДЭАЭ-целлюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке помещают на 1 ч в 0,5 л охлажденного до 4 С 0,25 М раствора хлористого натрия для десорбции церулоплазмина. Полученные 0,5 л элюата доводят раствором 1 н, соляной кислоты до рН 5,2 и производят доочистку препарата от липопротеидных примесей добавлением этилового спирта и хлороформа до конечной концентрации 25 и 4 об, )ь соответственно. Смесь перемешивают 30 мин при 25 С и образовавшийся осадок липопротеидов отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс.об/мин. К полученному центрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в растворе 55 об.;ь и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10 С на 18 ч, Образовавшийся осадок получают центрифугированием при 3 тыс.об/мин в течение 1 ч. Получено 1,35 г осадка, который был растворен и подвергнут стерилизующей фильтрации и лиофилизации, Окончательный выход препарата в данном примера составляет 0,45 г церулоплазмина на 1 кг исходного сырья. Его оптический коэффициент - 0,04, Биологическая активность - 17 усл,ед. Препарат апирогенный,П р и м е р 2. 30 кг осадка 11 фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 150 л охлажденного 0,05 М раствора хлористого натрия, рН 6.3, к гомогенату добавляют 3 кг активированной ДЭАЭ-целлюлозы, сорбцию осуществляют при слабом перемешивании на холоду(4 С) 18 ч. Целлюлозу помещают в х/б мешок и отмывают от сорбированных на ней неспецифицеских балластных белков, помещая его в сосуд с 50 л охлажденного 0,12 М хлористого натрия (эту процедуру повторяют трижды до оптической плотности отмывающейся от сорбента суспензии при длине волны 280 нм, равной 0,100),Отмытую ДЭАЭ-целлюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке на 1 ч помещают в сосуд с 1,5 л охлажденного 0,25 М хлористого натрия для десорбции церулоплазмина. Полученные 1,5 л элюата доводят раствором 1 н.НС до рН 5,2, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации в растворе до 25 и 4 об, соответственно, Смесь перемешивают 30 мин при 25 С, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс. об/мин. Кполученному центрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в рас182 б 193 Составитель С.МельниковаТехред М,Моргентал Корректор А,Обручар Редактор Л.Волкова Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 795 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 твора 55 об.и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10 Сна 18 ч. Образовавшийся осадок отделяютцентрифугированием при 3 тыс,об/мин втечение 1 ч. Получили 15 г осадка церуплазмина, который был растворен и подвергнутстерилизации и лиофилизации, Выход препарата церулоплазмина в данном примере .0,5 г на 1 кг исходного сырья. Оптическийкоэффициент Е 610/280 равен 0,042, Биологическая активность препарата составляла17 усл.ед. Препарат апирогенен. Преимущества заявляемого способаследующие: использование активированной целлюлозы, что значительно упрощает Формула изобретения СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРУЛОП ЛАЗ МИНА путем гомогенизации Ш фракции по Кону отходов производства гамма-глобулина в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ.-целлюлозе, элюции, осаждении 25 примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении из надосадочной стадию освобождения сорбированного на ней церулоплазмина от сопутствующих балластных белков, имеющих близкую сорбционную способность; осуществление элюции препарата церулоплаэмина без применения хроматогрфических колонок, с одной стороны, значительно упрощает процесс и время элюирования, а с другой - исключает потерю сорбента при элюировании и регенерации; проведение элюции церуплоплазмина 0.25 М раствором хлористого натрия позволяет исключить из технологии промежуточную стадию осаждения препарата этанолом, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения препарата церулоплазмина. жидкости целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, стерилизующей фильтрации и лиофилизации, отличающаяся тем, что, с целью сокращения числа стадий, сорбцию проводят на ДЭАЭ-.целлюлозе, активированной ионизирующим излучением высоких энергий непосредственно после гомогениэации в растворе хлористого натрия, а злюцию - 0,25 мл раствором хлористого натрия.