Способ определения активной фазы хронических заболеваний печени

(5)5 6 01 М 33/55 р ъ 1 емъ .1 Фу а) И НИЯ ицине и ки нали- заболе- овышеения ак- еваниях ЬЭ 0 СР мо зом ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Петрозаводский государственный университет им, О.В,Куусенина(56) Яхонтова О,И. и др, Значение иммунологических показателей в диагностике хронических заболеваний печени. - Врачебноедело; 1983, ЬЬ 4, с. 39-41.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОЙФАЭЬ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЯ.ЕВАНИЙПЕЧЕНИ(57) Изобретение относится к медицине, вчастности к гепатологии. Целью изобретеИзобретение относится к медможет быть использовано для оценчия активной фазы при хроническиваниях печениЦелью изобретения являетсяние точности и ускорение определтивной фазы при хронических эаболпечени.Способ осуществляют следующ Производят отбор крови, затем производят приготовление стандартного раствора рР. оставляют его на 60 мин при комнатной температуре, затем приготавливают набор стандартных растворов от 20 до 90, приготовляют раствор 0,24 г агарозы СЕВАК в. 20 мл вероналового буфера с р Н 8,6, ставят в водяную баню при 48 - 49 С, смешивают с раствором энтисыворотки, наносят смесь на стекло размером 85 х 85 мм,ния является повышение точности определения активной фазы при хронических заболеваниях печени и ускорение процесса оп ределени я. В сп особе проводят инкубацию исследуемой сыворотки крови и стандартных растворов с известной концентрацией иммуноглобулина Д в геле в течение 48 ч. Далее пластинку заливает 6-7 мл 1-го раствора трихлоруксусной кислоты на 2-3 мин, определяют уровень 1 дО и при уровне 1 цО выше 0,15 г/л определяют наличие активной фазы хронического заболева-, ния печени, Способ позволяет сократить время исследования на 24 ч и повысить. точность за счет стойкого повышения 190.1 табл,мтавляют на 30-40 мин для застывания геля. В слое гели с помощью шаблона выкраивают лунки на расстоянии 16 мм, в них помещают растворы стандарта М 1 - М 9 и исследуемые пробы в дубликатах. Пластины помещают во влажную камеру на 48 ч при комнаткой температуре. После окончания инкубации для улучшения видимости колец преципитации пластину заливают 6 - 7 мл 1 -го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) на 2 - 3 мин. В результате осаждения белков под действием ТХУ четко проступали кольца преципитации. После этого проводили измерение колец преципитации обычным способом. Весь процесс определения 190 составляет 48 ч. В контрольной группе здоровых лиц уровень 90 составил 0,13 й 0,01 г(л., Проведенный сопоставительный анализ прототипа и заявляемого способа показал, что общими являются вспособе определения 90 в крови как показателя активной фазы при хронических заболеваниях печени, включающий в себя растворение содержимого 2-х склянок со стандартом 90 набора ЮР фирмы СЕВАК каждую в 1 мл дистиллированной воды, оставляют при комнатной температуре на 60 мин, затем делают разведениерастворов стандарты от 90 до 20, растворов, затем из 0,24 г агарозы СЕВАК готовят раствор в 20 мл веронального буфера с рН 8,6 ставят в водяную баню при 48-49 и смешивают с раствором антисыворотки, 14 мл смеси наносят на стекло размером 85 х 85 мм, оставляют на 30 - 40 мин для застывания геля, в слое геля выкраивают лунки на расстоянии 16 мм друг от друга и в них помещают растворы стандарта от 100 до 20 О и исследуемые пробы сыворотки крови в дубликатах, пластинку помещают во влажную камеру на 48 ч при комнатной температуре, после чего промывают физиологическим раствором в течение 24 ч, сушат и окрашивают амидочерным, Отличительными признаками является то, что инкубированную пластинку в течение 48 ч заливают 6-7 мл 10 раствора трихлоруксусной кислоты и выдерживают поверхностный слой пла. стинки в течение 2 - 3 мйн, что способствует быстрому осаждению белка и ,прекращению реакции диффузии антител в слое агара и четкой визуализации колец преципитации 9 О. Способ осуществляет- ся с помощью стандартного набора СЕВАК (ЧССР),П р и м е р, Кровь в количестве 3 - 5 мл,взятая у больной смешанным циррозом печени в активной фазе из вены утром натощак, центрифугировалась при 1,5 тыс.оборотов в минуту в течение 5 мин. Сыворотка отсасывалась в количестве 0,5 мл в чистую пробирку. Готовились различные разведения стандартаДля этого содержимое одной склянки стандарта растворяли а 1 мл дистиллированной воды и оставляли при комнатной температуре в течение 60 мин до полного растворения стандарта.Приготавливалось 7 растворов стандартов; М 1 - исходный раствор (сухой стандарт, разведенный 1 мл дистиллированной воды), М 2 - 0,45 мл исходного раствора М 1 + 0,05 мл физиологического раствора - 90 ф-й раствор; М 3 - 0,40 мл исходного раствора М 1-0,10 мл физиологического раствора - 80%-й раствор; М 4 - 0,35 мл исходного раствора М 1 + 0,15 мл физиологического раствора - 70;-й р-р; М 5 - 0,30 мл исходного раствора М 1 + 0,20 мл физраствора - 60-й р-р; М 6 - 0,10 мл исходного раствора М 1+ 0,10 мл физиологического раствора - 50 -й р-р; Ь 7 - 0,10 мл раствора М 3+ 0,10 мл физиологического раствора - 40 О-й р-р.Приготовление раствора агарозы длязаливки пластины.Отвешивается 0,24 г агарозы и растворяется в горячем состоянии в 20 мл верона лового буфера (рН 8,6, ионная сила 0,1),после полного растворения пробирка поме- "0 щается в баню при 48 - 49 О. В другой сосудпри той же температуре отмеривали пипеткой 15 мл раствора агарозы, Раствор агарозы смешивается с антисывороткой, Для этого содержимое одной склянки антисыво- "5 ротки растворяется в 3 мл дистиллированной воды. После полного растворения содержимого склянка помещается на 20-30 мин вбаню при 48 - 49, Затем переносится содержимое одной склянки к отмеренному 20 раствору агарозы и хорошо перемешивается. 14 мл смеси агарозы с антисывороткой наносится на пластину размером 85 х 85 мм, .Расположенную строго горизонтально, Слой геля оставался застывать в течение 25 30-40 мин при комнатной температуре, втечение этого времени пластина хранилась во влажной камере, С помощью шаблона в геле выкраивались лунки диаметром 1,75 мм на расстоянии 16 мм. В выкроенные лунки 30 помещались стандартные растворы йг 1 - 7 спомощью микрошприца, Каждое разведение стандарта помещалось в 2 лунки, Таким образом 14 лунок заполнялось стандартными растворами. В следующие 2 лунки поме щалась исследуемая сыворотка больного,Лунки заполнялись до самого края вплоть до исчезновения мениска. Пластинка хранилась во влажной камере при комнатнойтемпературе в,течение 48 ч. После этого 40 поверхность геля осторожно заливалась 6-7.мл раствора трихлоруксусной кислоты 1 на 2 - 3 мин, за это время четко проявлялись кольца преципитации, раствор сливался и измерялись радиусы преципитационных ко лец, Строился график, для чего на ось абсцисс наносились показатели квадратов радиусов (средних) преципитационных колец стандартных растворов в мм, на ось ординат - соответствующие концентрации в50 г/л. Через полученные точки проводиласьпрямая. Диаметр двух колец преципитации исследуемого больного равнялся 8,2 и 8 мм, средний диаметр 8,1 мм, радиус 4,05 мм, квадрат радиуса 16,4, По оси ординат зто соответствует концентрации иммуноглобулина 0 = 0,21 г/лПри повторных исследованиях при лечении больных ХЗН уровень 90 нормализуется в более поздние сроки, В таблице показана динамика различных показателей1826065 Динамика показателей активности ХЗП гри лечении Составитель Г. Крюкова Редактор С. Никольская Техред М.Моргентал Корректор С, Шекмараз 2319 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям пр113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5. ГКНТ СС одственно-издательский комбинат Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 10 активности у больных ХЗП в процессе лечения. Из таблицы видно, что уже через 3 недели .большинство показателей,активной фазы вернулись к нормальному уровню. в то время как дО сохраняется повышенным и только через 1 месяц дО снижается до нормы, что указывает на стойкость повышения дО при активных процессах и, таким образом, при его снижении можно считать, что активность действительно ликвидирована. Таким образом, предлагаемый способ определения дО позволяет: 1 - сократить время исследования на 24 ч, 2 - повысить точность определения активной фазы ХЗП, особенно при ее затухании,Способ апробирован в условиях терапевтического отделейия городской больницы г.Петраэаводска. Формула и зоб рете н и я Способ определения активной фазыхронических заболеваний печени, включающий йнкубацию исследуемой сыворотки крови и стандартных растворов иммуног лобулина в лунках на пластине с гелем,содержащего специфическую антисыворотку и по диаметру колец препитации определяют уровень иммуноглобулинов в крови больного, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 10 что, с целью повышения точности и уско: рения диагностики, определяют в кровиуровень сывороточного иммуноглобулина О и, досле инкубации исследуемой сыворотки и стандартных растворов дОв геле 15 в течение 48 ч пластину обрабатывают 1 м раствором трихлорукаусной кислоты в объеме 6-7 мл в течение 2 - 3 мин и при уровне дО выше 0,15 г/л определяют наличие активной фазы хронического за болевания печени.