Способ получения коллагеназы

(5)1 С 12 й 9/58 ОЮЗНАЯТСАЯЛф 4 ЕСМФ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ О; АН СССРкороипбз аког Веептз "Я 9 ва"- 22 кл. ОЛЛАГЕНАЗЫ ОЛОГИЯ, В ЧдСТ- в микробного парфюмерная ГОСУДАРС ГВЕН СЕ Г 1 АТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ К (57) Использование: биотех ности получение ферменто происхождения, медицина. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментов микробного происхождения, и может быть использовано в медицине при терапии ожоговых ран, обморожений (препарат "Ируксол", Югославия), некоторых заболеваний печени, грыжи интервертебрального диска позвоночника, для получения и культивирования клеточных культур человеческих и животных тканей, являющихся источником активаторов плаэминогена в тромболитической терапии, а также в парфюмерной промышленности и НИР, например, для определения структуры коллагенов,Цель изобретения - увеличение активности фермента, удешевление процесса его получения.Укаэанная цель достигается тем, что в качестве продуцента коллагеназы используют актиномицет 5 тгерюпусез 1 ачепбцае ВКГ 1 М-910 (ИНМИ-Р/). Культивирование которого осуществляют в течение 48-72 ч при температуре (282)"С и рН 6,4 - 6,8 на 5 Ц 1822879 А 1 промышленность и НИР, Сущность иэобоетения: в качестве продуцента кпллагеназы используют актиномицет ЯтгерГогпусез 1 ачепОоае ВКПМ-910(ИНМИЯ/) культивирование которого осуществляют в течение 48 - 72 ч при температуре (28) С и рН 6.4-6,8 на питательной среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18-20; препарат М 1 (мука кормовая животного происхождения) 1,5 - 2.0; желатин 2,5-3,0; М 9504 7 Н 20 0,2-0,4: остальное - вода водопроводная, до достижения активности фермента в культуральной жидкости 10- 20 ед/мл, в препарате 135 в 1 ед/мг питательной среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18-20, препарат М 1(мука кормовая животного происхождения, отходы ГОСТ 17536-82) 15 - 20. желатин 2,5- 3,0, М 9504 7 Н 20 0,2-0,4, вода водопроводная. Среду разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера обьемом 250 мл. Посевной материал вносят в количестве 10(. Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) при (28 ) С в течение 48-72 ч, Мицелий отделяют центрифугированием при 6000 об/мин, Осаждение ферментов из кчльтуральной ЬЭ жидкости осуществляют ацетоном при тем- Я пературе 0 - 5 С. Коллагенаэную активность (,"ф осажденного ферментного препарата определяют с помощью нингидринового метода с 0 и выражают в ед. лей/мл к,ж. или мг препарата.Коллагеназная активность в культчральной жидкости составляет 10-20 ед.лей/мл, а в осажденном лиофилиэированном препарате - 135 - 185 ед.лей/мг (в мкмоль лейцина) эа 18 ч инкубации реакционной смеси, 182287945 50 55 и ельными признаками предлагаемого способа является то, что в качестве продуценга коллагенаэы используют актиномицет Ягерютусез ачепбоае ВКПМ-Я (ИНМИ-Р/), который выращивают в течение 48-72 ч при температуре (28 ы)С и рН 6,4-6,8 на питательной среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18-20, препарат М 1 (мука кормовая животного происхождения, отходы. ГОСТ 17536-82) 15-20, желатин 2.5 - 3,0, МцЮ 4 7 Н 20 0,2 - 0,2, вода водопроводная, Среду разливают па 50 мл в колбы Э рленмейера обьемом 250 мл. Посевной материал вносят в количестве 10 ( Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) при (28+2) С в течение 48-72 ч, Мицелий отделяют центрифугированием при 6000 об/мин. Осаждение ферментов из культуральной жидкости осуществляют ацетоном при 0 - 5 С. Коллагеназная активность осажденного ферментного препарата определялась с помощью нингидринового метода и выражалась в ед. лей/мл к.ж, или мг препарата.Коллагенаэная активность в культуральной жидкости составляет 10 - 20 ед. лей/мл. в осажденном лиофилизированном- препарате - 135 - 185 ед. лей/мг (в мкмоль лейцина), за 18 ч инкубации реакционной смеси.Увеличение или уменьшение вышеуказанных концентраций компонентов среды отрицательно влияет на синтез коллагенаэы - активность снижается на 10-50. При температуре ниже и выше указанных пределов, исходных значениях рН ниже 6,4 и выше 6,8 снижается скорость роста и ферментативная активность, При сокращении менее 48 ч или увеличении более 72 ч времени выращивания активность также снижается,Изобретение иллюстрируется следую щими примерами,П р и м е р 1. Культуру 51 гер 1 оаусез ачепбоае ВКГ 1 М-910 (И-МИ-Зч) выращивают на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18, препарат М 1 1,5, желатин 2,5, Мц 504 7 Н 20 0,2, остальное - вода водопроводная, рН 6,6, Посевной материал вносят в количестве 10. Выращивание проводят при 28 С в колбах на 250 мл в 50 мл среды на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч, Культуральную жидкость отделяют центрифугированием (6000 об/мин) при охлаждении. Осаждение ферментов проводят при температуре 0 - 5 С, Осадок лиофилизируют и определяют коллагеназную активность по нингидриновому методу по лейцину (15) через 18 ч инкубации реакционной смеси,5 10 15 20 25 30 35 ДЪ Коллагеназная активность культуральной жидкости равна 12 ед/мл, лиофилиэированного препарата - 135 ед/мг.П р и м е р 2. Культуру 3(герсоеусез ачепбоае ВКПМ-910 (ИНМИ-Р/) выращивают нв среде следующего состава, г/л; кукурузная мука 20, препарат ЬВ 1 20, желатин 3.0. Мц 504 7 Н 20 0,4. остальное - вода водопроводная, рН 6,8. Посевной материал вносят в количестве 10, Выращивание проводят при 30 С в колбах на 50 мл в 50 мл среды, на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием (6000 об/мин) при охлаждении. Осаждение ферментов проводят при 0 - 5 С. Осадок лиофилизируют.Коллагенаэная активность культуральной жидкости равна 16 ед/мл, а лиофилизированного препарата - 150 ед/мг за 18 ч инкубации реакционной смеси,П р и м е р 3, Культуру 31 гер 1 оаусез ачепбцае ВКПМ-910 (ИНМИ-Р/) выращивают на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 20, препарат М 1, 20, мелатин 3,0, Мц 304 7 Н 20 0,4, остальное - вода водопроводная, рН 6,5. Выращивание проводят по примеру 2. но в течение 72 ч. Коллагенаэная активность в культуральной жидкости равна 20 ед/мл, в лиофилизированном препарате - 185 ед/мг за 18 ч инкубации реакционной смеси.Применение предлагаемого способа позволяет получить из культуральной жидкости актиномицета Ятгер 1 оаусез ачепбцае ВКПМ-910 (ИНМИ-ЯЧ) активную коллагеназу.Коллагенаэная активность осажденного из культуральной жидкости препарата до 1,5 раза превышает активность препарата, олученного по известному способу. В предлагаемом способе используют простую и дешевую питательную среду. Формула изобретения Способ получения коллагеназы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, желатин, сульфат магния семиводный до достижения максимальной активности, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения активности фермента и удешевления способа. в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм 31 гертопусез ачепбоае ВКПМБ, а культивирование ведут при температуре 26-30 С, рН 6,4-6,8 на питательной соеде, содержащей в качестве источника углерода кукурузную муку, источника азота -1822879 Составитель Н,ДеминаТехред М.Моргентал Корректор М.Куль Редактор Г.Бельская Заказ 2174 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Рэушская наб 4/5 Производственно-издательский ком инат атент, г. жгород, ул. агарина белковый препарат М 1 при следующем соотношении компонентов, г/л: Кукурузная мука 18-20 Белковый препарат М 1 1,5 - 2,0 Желатин 2,5-3,0 Сульфат магния семиводный 0,2-0,4 Вода водопроводная Остальное.