Способ снижения неспецифической флуоресценции при иммунофлуоресцентной микроскопии клеточных белков

)5 6 33 5 ЕТЕ ИКРОС КОПИ генет ых ткаЦИФИ- ИММУГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Институт клеточной биологиической инженерии АН УССР(56) Новые методы культуры живоней. М,: Мир, 1976, с. 229-234,(54) СПОСОБ СНИЖЕНИЯ НЕС ЧЕСКОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПР Изобретение относится к клеточной биологии, а именно к иммуноцитохимическим методам исследования, и может быть использовано в лабораторной практике,Цель изобретения - улучшение качества свечения комплекса антиген-антитело при иммунофлуоресцентной микроскопии биологических образцов за счет снижения неспецифической флюоресценции.Поставленная цель достигается путем истощения вторичных антител с помощью обработки протопластами, полученными из высших растений, Роль связывающих белков в этом случае могут выполнять лектины, биологическая активность которых сходна с таковой гликопротеидов печени. Формируя рецепторные участки на поверхности мембраны растительной клетки, они сохраняются в нативном состоянии в изолированных протопластах и поэтому могут обеспечивать большую степень истощения вторичных антител (сыворотки). В результате такой процедуры значительно снижается неспецифическое свечение исследуемых обьектов,ЙЛ 1804626 АЗ НОФЛУОРЕСЦЕНТНОИ М И КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ(57) Использование: биотехнология, иммуноцитохимические методы исследования, Сущность изобретения: для снижения неспецифической флуоресценции при исследовании клеточных белков предложено истощать вторые антитела суспензией протопластов, В результате эффективность иммунофлуоресцентной микроскопии резко повышается за счет уменьшения фонового свечения,Сущность изобретения заключается в том, что концентрированную суспензию протопластов, полученных после соответствующей обработки растительной ткани или культивируемого каллуса ферментной смесью на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, добавляют к вторичной сыво- ф ротке, меченной флуоресцентным зондом, в соотношении 1;1 (объем/объем) для ее истощения. После инкубации истощенную таким образом сыворотку очищают от примесей и используют для иммунофлуоресцентной микроскопии.П р и м е р 1. Лиофилизированная сыворотка (вторичные антитела) разводилась 0,15 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2 (из расчета 1 мг сыворотки на 1 мл буфера), После легкого встряхивания пробирку со смесью сыворотки и протопластов выдер-. живали при комнатной температуре 55-60 мин, периодически взбалтывая во избежание осаждения протопластов, Затем смесь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Очищенную таким образом от протопластов сыворотку переносили в другую пробирку иразводили до концентрации, необходимой в конкретном опыте, После этого ее еще раз центрифугировали при 12000 об/мин на протяжении 5-7 мин.Параллельно получали протопласты путем обработки каллуса табака йсотапа саЬасца смесью целлюлолитических ферментов. Свежеизолирован ные протопласты наносились на предметное стекло с полилизином и фиксировались в 3,7 ф -ном параформальдегиде в течение 60 мин, Фиксированные клетки пермеабилизировали 1 ф -ным тритоном Хв течение 30 мин. После промывки в буфере, содержащем 0,05 М МЕЯ, рН 6,7 0,05 М КС, 2 мМ Мя С 2, 10 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА, полученные образцы обрабатывали первичными антителами ктубулину(основному белкумикротрубочек) (6) и вторичными антителами, истощенными, как указано выше.Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии кортикальных микротрубочек в исследуемых протопластах показывают, что при обработке клеток вторичными анти- телами после их истощения в соответствии с предложенной процедурой качество получаемых изображений лучше, чем при обработке клеток вторичными антителами без истощения, Это выражается в резком снижении уровня неспецифического свечения наблюдаемых объектов, что позволяет более четко визуализировать пучки микротрубочек как в примембранном слое, так и в цитоплазме протопластов.П р и м е р 2. Культивируемые лимфоциты линии Мос(Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз) наносились на предметное стекло с полилизином и фиксировались в 3,7 ф -ном параформальдегиде в течение 10 мин, Дальнейшая подготовка образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии, включая использование первичных антител к тубулину, истощение вторичных антител и обработку ими биологического материала проводилась в соответствии с процедурой, изложенной в примере 1.В результате обработки лимфоцитов вторичными антителами, истощенными протопластами, качество визуализации микротрубочек резко улучшается за счет снижения неспецифического свечения образцов и соответствующего уменьшения фона. При этом удается наблюдать отдельные нити упорядоченной сети цитоплазматических микротрубочек,П р и м е р 3. Каллус табака %сотапа саЬасцщ обрабатывали смесью целлюлолитических ферментов по методике (4) для получения протопластов. Фиксацию и пермеабилизацию протопластов осуществ 45 50 55 5 10 15 20 25 30 35 40 ляли как описано в примере 1, Подготовленный таким образом материал обрабатывали первичными антителами АРВ, специфически узнающими белки промежуточных филаментов в растительной клетке и реагирующими с белками промежуточных филаментов животной клетки, Истощение вторичных антител и окрашивание ими образцов производили аналогично процедуре, описанной в примере 1.Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии промежуточных филаментов в исследуемых протопластах показывают, что при обработке материала вторичными анти- телами после их истощения удается получить четкое изображение визуализируемых структур в сравнении с обработкой клеток вторичными антителами без истощения.П р и м е р 4. Лимфоидные клетки Моснаносились на предметное стекло с полилизином. Фиксированные и пермеабилизированные клетки (см, пример 2) обрабатывались первичными антителами МРМ, которые узнают фосфорилированные белки в интерфазных и митотических клетках, связанные с ядерной оболочкой, Последующая подготовка вторичных антител и обработка ими клеток производилась согласно процедуре, описанной в примере 1.При исследовании взаимодействия антител МРМслимфоидными клетками Мот установлено, что обработка образцов истощенными протопластами вторичными антителами позволяет идентифицировать антигены к первичным антителам в составе ядерной оболочки, в то время, как другие компоненты клеток характеризуются низкими уровнями неспецифического свечения, чего не удается достичь при общепринятых процедурах истощения вторичных антител или при использовании их без истощения.П р и м е р 5. Процедура подготовки протопластов из каллуса Исобапа 1 аЬасцт проводилась согласно известной методике,После получения свежеизолированных протопластов они подвергались фиксации и пермеабилизации как описано в примере 1. Подготовленные клетки обрабатывались первичными антителами МРМ, полученными против перицентриолярного материала, входящего в состав центров организации микротрубочек, а затем вторичными антителами, истощенными как описано в примере 1.Использование в данном случае истощенных протопластами вторичных антител позволяет достичь более четкой идентификации диспергированных в цитоплазме свежеизолированных протопластов компонентов центров организации микротрубо1804626 Формула изобретения 15 20 25 30 35 40 50 Составитель С. ЕщенкоРедактор Т, Куркова Техред М,Моргентал Корректор И.Муска Заказ 1078 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 чек без заметного фона, обусловленного неспецифической флуоресценцией,Таким образом, приведенные примеры показывают, что истощение вторичной сыворотки протопластами позволяет улучшить качество результатов иммунофлюоресцентной микроскопии клеточных белков за счет снижения уровня неспецифической флуоресценции, Кроме того, при использовании самих протопластов в качестве объектов для иммунофлюоресцентной микроскопии становится возможным применение их же для истощения сыворотки. Способ снижения неспецифическойфлуоресценции при иммунофлуоресцент ной микроскопии клеточных белков, предусматривающий обработку комплекса выявляемых белков и специфических первых антител вторыми истощенными антителами, меченными флуоресцентным зондом, 10 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения эффективности способа вторые антитела истощают суспензией протопластов растений в соотношении 1:1.