Способ определения концентрации меди и железа в грудном молоке

(ГОСПАТЕНТ ССС ПАТЕНТН ОПИСА ИЗОБРЕТЕН ДЕТЕЛ ЬСТВ ОРС КОМУ е- о- и яю- при деления конценгрудном молоке ционной спектро(21) 4883735/04,Инструкция по применению коммерческого набора Био-Ла-Тест "Медь", БИО-ЛаТест "Железо", ЛАХЕМА, Ч СФ Р.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА В ГРУДНОМ МОЛОКЕ Изобретение относится к аналитич ской химии и медицине, а именно к спос бам количественного определения железа меди в грудном молоке кормящей матери и может быть использовано при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери железа и меди, явл щихся гемопотическими факторами гемоглобинообразовании,Известен способ опретрации меди и железа вметодом атомной-абсорбфотометрии.Недостатком способа является длительность определения из-за длительности подготовки пробы к анализу.Наиболее близким к описываемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения же(о.Ыдо 1 797 О 2 1 А 1(57) Использование: в аналитической химии и медицине при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери биометаллов - железа, меди и др являющихся гемопотическими факторами при гемоглобинообразовании. Сущность изобретения; анализируемую пробу молока депротеинезируют, обрабатывают смесью, метанола 30 - 35 об.и хлороформа 65-70 об. Д. и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в одной пробе с последующим спектрофотометрированием окрашенных растворов. Время проведения определения 44 мин. 1 табл. леза и меди в грудном молоке путем депротеинизирования анализируемой пробы отдельно для меди и отдельно для железа разными растворами с последующей обработкой депротеинизированных проб цветореагентами и спектрофотометрировэнием окрашенных растворов.Недостаток способа тот же - длительность проведения определения.Целью изобретения является сокращение времени определения.Поставленная цель достигается описываемым способом определения концентрации железа и меди в грудном молоке путем депротеинизирования анализируемой пробы, обработки метанол-хлороформной смесью состава,объем метанол 30-35, хлороформ 65 - 70 и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в однойпробе, 1797021Отличительным признаком способа является обработка депротеинизированной пробы метанол-хлороформной смесью состава,объем метанол 30 - 35, хлороформ 65-70 и определение биометаллов последовательно в одной пробе,Изобретение иллюстрируется следующим примером, Аликвоту молока (пробу) в объеме 1 мл дозатором переносят в чистую стеклянную центрифужную пробирку и подвергают депротеинизации добавлением 1 мл смеси для осаждения белков(концентрированная тиогликолевая кислота, трихлоруксусная кислота 0,6 моль/л, соляная кислота 2 моль/л). Суспензию тщательно перемешивают, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант (надосадочную жидкость) отбирают при помощи дозатора в объеме 1 мл. переносят в чистый стеклянный сосуд с притертым шлифом и смешивают с 1 мл смеси метанол-хлороформ ("Реахим", хч) в соотношении 30 мл метанола и 70 мл хлороформа, Далее эту суспензию интенсивно встряхивают в течение 2 мин и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Экстрагированные липины и липопротеиды собираются на границе раздела двух фаз - плотной (хлороформ) и менее плотной (метанол), При помощи дозатора отбирают верхнюю фазу в обьеме 1 мл, переносят в чистую центриФукную стеклянную пробирку и смешивают сначала, с 1 мл реагента на медь (2, 9-диметил, 7-дифенил, 10-фенантролин-З, 6-дисульфонат). После смешивания пробу оставляют стоять в течение 5 мин, времени в течение которого развивается интенсивное желтое окрашивание (стабильное окрашивание сохраняется в течение не менее 1 ч после добавления реагента). Параллельно готовят аликвоты раствора сравнения и эталонного раствора. Раствор сравнения представляет собой смесь 1 мл бидистиллированной воды и 1 мл смеси для осаждения белков. Эталонный раствор в процедуре определения меди представляет собой смесь 1 мл эталонного раствора, содержащего 30 мкмоль/л меди и 1 мл смеси для осаждения белков, Из 2 мл исходных растворов сравнения и эталонного отбирают по 1 мл каждого и смешивают их с 1 мл смеси метанол-хлороформ. После добавления смеси метанол-хлороформ пробы, содержащие раствор сравнения и эталонный раствор, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. При помощи дозатора отбирают верхнюю фазу в объеме 1 мл, переносят в чистую центрифужную стеклянную пробирку и смешивают с 1 мл реагента на медь, Оптическую плотность пробы и эталонного раствора измеряют против раствора сравнения в кварцевой кювете(длина светового пути 1 см) на спектрофотометре СФпри длине волны 480 нм,Расчет концентрации меди в пробе молока производят по формуле Х= - хС,АБ 10 40 45 в эталонный раствор железа. Раствор сравнения представляет собой смесь 0,5 мл бидистиллированной воды и 0,5 мл смеси для осаждения белков, а эталонный раствор - 0,5 мл смеси для осаждения белков и 0,5 мл эталонного маточного раствора, содержащего 17, 9 мкмоль/л железа, Раствор сравнения и эталонный раствор также подвергают обработке смесью метанол-хлороформ, после чего пробы содержащие эти 50 55 растворы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Дозатором отбирают верхнюю Фазу в объеме 1 мл и добавляют последовательно сначала 1 мл реагента на медь и затем 1 мл реагента на железо,Оптическую плотность проб при определении содержания в них железа и эталона измеряют против раствора сравнения.Расчет концентрации железа в пробе производят по формуле где Х - содержание меди в пробе вмкмоль/л, А - оптическая плотность пробы,Б - оптическая плотность эталонного рас 15 твора, С - концентрация меди в эталонномрастворе после обработки смесью метанолхлороформ в мкмоль/л, т, е. содержание меди в эталонном растворе с учетомразбавления маточного эталонного раство 20 ра после обработки смесью метанол-хлороформ.Время определения концентрации меди в пробе грудного молока, а также погрешность этого определения приведены в25 таблице.После определения содержания медив этих же пробах проводят определениеконцентрации железа, для чего в каждуюпробу добавляют по 1 мл реагента на ке 30 лезо (батофенантролин, т. е, 4, 7-дифенил, 10-фенантролин) и оставляютстоять не менее 5 мин. После развитияинтенсивной розовой окраски раствораизмеряют оптическую плотность проб на35 спектрофотометре СФв кварцевойкювете (длина светового пути 1 см) придлине волны 535 нм,Для расчета содержания железа в пробах параллельно готовят раствор сравнения1797021 У= - х С х 2.А Б Формула изобретения Способ определения концентрации ме, ди и железа в грудном молоке путем депротеинезирования анализируемой пробы с последующей обработкой цветореагентами и спектрофотометрированием окрашенных П р и ы е ч а н и е: + - приведенные данные являются среднеотатистической величиной от о исследований;- разброс значений в 5 определенилк так велик. что выловит за границы достоверности. Составитель С.ХованскаяРедактор О.Стенина Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец Заказ 649 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 где У - концентрация железа в пробе в мкмоль/л, А - оптическая плотность пробы, Б - оптическая плотность эталонного раствора, С - концентрация железа в эталонном растворе после обработки смесью метанол-хлороформ в мкмоль/л,2 - коэффициент, компенсирующий разбавление проб и эталона за счет добавления 1 мл реагента на медь,Депротеинизурующую смесь для денатурации белков молока готовят, смешивая 3 мл концентрированной тиогликолевой кислоты в мерной колбе емкостью.100 мл с трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 0,6 моль/л, содержащей также соляную кислоту в конечной концентрации 2 моль/л.Цветореагенты на медь и железо в описываемомспособе используют в готовом виде из коммерческих наборов Био-Ла-Тест "Медь" и нЖелеэо". В отсутствии готовых цветореагентов их готовят следующим образом, на железо - в пробирке к 100 мг 4,7-дифенил, 10-фенантролина (батофенантролина) добавляют 0,5 мл хлорсульфоно 5 вой кислоты, нагревают на кипящейводяной бане в течение 30 с, охлаждают имедленно приливают 10 мл воды, после чегоснова нагревают на водяной бане 5 мин иразбавляют 100 мл дистиллированной воды.10 Устанавливают рН 4,0, добавляя раствор 5н. МаОН, и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл. цветореагент на медьготовят аналогичным образом, только вместо 4, 7-дифенил, 10-фенантролина ис 15 пользуется его производное - 2,9-диметил, 7-дифенил, 10-фенантролин,Время определения концентрации железа в пробе грудного молока, а также погрешность этого определения приведены в20 таблице,Суммарное время определения железаи меди по описываемому способу составляет 38 - 44 мин (по известному 80 мин) при тойже чувствительности и точности,.25 растворов, отл ича ю щи й ся тем, что, с целью сокращения времени определения, 30 депротеинезированные пробы перед обработкой цветореагентом обрабатывают смесью метанола 30-35 об.и хлороформа 65 - 70 об. ои определение железа и меди ведут последовательно в одной пробе,