Способ концентрирования бактериальных спор

) Всесоюзный научно-исследовательский титут ветеринарной вирусологии и микиологии) И,А, Бакулов, В,А. Гаврилов, Ю В. Чис, М.И, Калэбеков и А.В, Никитин ) 3, Во. Спев зажгу, 1981, ч. 25 б, р, 7557; Авторское свидетельство СССР 835170, кл. С 12 М 1/02, 1983,ТЕРИАЛЬНЫХ СПОР(57) Область использования; микробиология,концентрировэние спор,споровые вакцины, вакцина против сибирской язвы. Сущность изобретения; в суспензию спор вносят йолиэтиленимин до конечной концентрации 0,05. - 0,1. Проводят отстаива- йие при температуре 1-15 С и рН 6,0-8,0. Время осаждения спор составляет 4-5 суток, Способ обеспечивает оптимальные условия для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, 1 табл.. Изобретение относится к биологическ й промышленности и может быть использо ано при изготовлении живых споровых ли филизированных вакцин и концентратов живых споровыхжидких вакцин против бактеиальных болезней животных.В настоящее время при изготовлении живых споровых лиофилизированных вакцин для концентрирования спор применяют способ их осаждения путем отстаивания.Осаждение бактериальных спор, полученных на плотных питательных средах и рэ 4 успендированных в физиологическом растворе, проходит за 10 и более суток.Осаждение спор; полученных суспензион ым способом в реакторе, проходит зйачи ельно дольше(более, чем зэ 35 суток), что об ясняется повышенной вязкостью жидко фазы, связанной с наличием в жидкости белкового субстрата - продукта лизисэ бактериальных клеток и не утилизированных ко понентов питательной среды.Поскольку биологическая промь 1 шленность переходит на более прогрессивный суспензионный способ изготовления вакцин, то такое длйтельное (более месяца) концейтрирование спорового материала использовать не технологично.Нецелесообразно также применять из- О вестный способ концентрирования споро- Я вого материала путем центрифугирования. К) При центрифугировании, особенно больших ( объемов споросодержащей жидкости, оченьО трудно создать условия; при которыхполностью исключались бы загрязнение отделяе-, ,с мых спор (полуфабриката вакцины)Ф микрофлорой. воздуха и выброс спорового ф материала во внешнюю среду.Наиболее близким является способконцентрирования микроорганизмов малых размеров путем отстаивания с использованием белкового щелочного экстракта в качестве вспомогательного вещества.К недостаткам этого способа относится то, что осаждение осуществляют в условиях(температура 90 С и рН 3,0), которые явля- спор в суспензии. В последующие сутки ются губительными для живых микроорга- процент спор в надосадке не увеличился, В низмов и поэтому данный способ контрольном флаконе втечение 5-дневного невозможно йспользовать при изготовле-, срока практически не было зарегистрировании живых бактериальных вакцин., 5 но осаждения спор, Его выдержали еще 30Целью настоящего изобретения являет- дней в холодильнике, но и в этом случае в ся повышение жизнеспособности микроор- осадке оказалось не более 50% спор, приганизмов. чем осадок был неплотный и легко разбивалПоставленная цель достигается тем, что ся.при отделении микроорганизмов от жидкой "0 При сравнении внешнего вида суспенфазы, включающем осаждение с использо- зии после 4-дневного отстаивания в опытваниемвспомогательноговещества,вкаче- ном и контрольном флаконах было стве вспомогательного веществаиспользуют зарегистрировано, что в опытном флаконе полиэтиленимин -СН 2 СНЕГИН-) в оптималь-, прошло хорошее осаждение бактериальных ной концентрации 0,05 - 0,1%. Другое отли спор - надосадок был почти прозрачный, а чие состоит в том, что осаждение проводят осадок плотный. В контрольном флаконе при температуре 1 - 15 С, признаки осаждения не были выражены,Кроме того, осаждение осуществляют По окончании осаждения (4 суток) из при рН 6,0 - 8,0. опытного флакона, соблюдая стерильность,П р и м е р 1. Суспензию, содержащую 20 декантируют надосадок. Осадок в количест. в 1 мл 215 млн жизнеспособных спор вакци- ве 80-100 мл, содержащий 4-5 млрд жизнеоннога сибиреязвенного штамма 55-ВНИ- способных спор/мл, используют для ИВВиМ, полученную в реакторе, имеющую изготовления кбнцентрата вакцины или для рН 7,0 -ф. 0,2, разливают, соблюдая стерйль- приготовления лиофилизированной вакциность, в 2 двухлитровых.роллерных флакона 25 ны против сибирской язвы животных.по 2 литра в каждый, В один (опытный) В практике биопредприятий при осажфлакон добавляют 10 мл 10%-ного водйого дении бактериальных спор целесообразно раствора полиэтиленимина (ПЗИ), просте- использовать 18-литровые стерильные балрилизованного при температуре 120 + 2 С лоны с сифонами для перекачивания жидков течение 30 минут, при этом концентрация 30 стей.ПЭИ в спорбсодержащей жидкости состав- При добавлении в сйоровую суспензию ляет 0,05%. Второй флакон используют в ПЗИ в количестве 0,1% осаждение бактерикачестве контрольного, Из контрольного альных спор проходит так же хорошо, как и флакона отбирают исходную пробу в коли- при добавлении 0,05%, После 4-дневного честве 1 мл и методом 10-кратных разведе осаждения при температуре 4 + 2 С в ний в физиологическом растворе с осадке находятся 95% спор.последующим посевом разведенйй на чаш- При добавлении в споровую суспензию ки Петри с 2%-ным мясо-йептоннымагаром, ПЭИ в количестве 0,0125% и меньше или их инкубированием при 37 +1 С в течение 0,4% и больше осаждение спор проходит 20-24 часов и подсчетом выросших колоний 40 медленно. За 5 суток отстаивания при темопределяют число жизнеспособных спор в пературе 4 ". 2 С в осадке находятся мень мл пробы, Оба флакона йомещают в холо-ше 30% бактериальных спор.дильник при температуре 4 +2 С, В тече- Прииспользованиитемпературы 16 Си ние 5 дней через каждые 24 часа из верхней, выше осаждение бактериальных спор не засредней и нижней части опытного флакона 45 медляется, Однако в этих условиях часть отбирают пробы споровой суспензии в ко- микроорганизмов может перейти из спороличестве 1 мл, обьединяют их в усреднен- вой в вегетативную форму, что является неную пробу, в которой определяют число допустимым при изготовлении вакцины. жизнеспособных спор по методу, описанно- При использовании температуры ниже му выше, Таким же путем определяют число 50 ОС происходит кристаллизация споровой спор в пробах из контрольного флакона. суспензии, которая может привести к гибеПолученные результаты отражены в ли части микроорганизмов,таблице,: . При рН 5,0 или 9,0 осаждение бактериИз данных табл. 1 видно, что в опытном альных спор не замедляется. Однако кислая флаконе после 4-дневного отстаивания в 55 или щелочная среда является неблагоприятнадосадке из 215 млн спор/мл осталось ным фактором и может привести к гибели лишь 10 млн спор/мл, следовательно, ос- . части микроорганизмов.тальные споры находились в осадке и их Использование предлагаемого способа количество составило 95% от общего числа концентрирования бактериальных спор, по1792969 Формула йзобретения н з и менение числа бактериальных спор в надосадке пр пензии аивани Составитель В,РомановТехред М,Моргентал орректор С.Пекарь Ре актор За, аз 482 ВНИИТираж. ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушскэя наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,5с авнению с существующими способами, о еспечивает следующие преимущества;а) в качестве вспомогательного вещества, применяемого для отделения спор от жидкой фазы, используют полиэтилени мин в оптимальной концентрации 0,05 - 01%1-15 С;б) позволяет проводить концентрирован е бактериальных спор при температуре10 Способ концентрирования бактериальх спор, включающий внесение в суспеню спор вспомогательного вещества с следующим отстаиванием полученной еси и отделением осадка, о т л и ч а юУв) дает возможность осуществлять отделение спор от жидкой фазы при рН 6,0-8,0;г) позволяет получать в стерильных условиях из споросодержащей жидкости концентрированный споровой материал - полуфабрикат для изготовления лиофилизированных вакцин или концентрата жидких вакцин;д) время осаждения бактериальных спор составляет 4-5 суток. щ и й с я тем, что, с целью повышения жизйеспособности микроорганизмов, в качестве вспомогательного вещества используют полизтиленимин, вйосят в суспензию до конечной концентрации 0,05 - 0,1, а отстаивание проводят при температуре 1- 15 С ирН 6 - 8,