Способ определения патогенности бледной трепонемы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 2 О 1/О ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ сследовадко металредмет" и енствова, Милич, Ю.К,Л. Пирузян 101 - 133.ПАТОГЕН" медициня, биониепонемы ной пленВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Государственный научно-ительский и проектный институг релической промышленности "ГиЦентральный институт усовершния врачей(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯНОСТИ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ(57) Использование: медицина,ская диагностика, магнитобиологика. Сущность изобретения: трпомещают на поверхность магнит Изобретение касается вопросов бионики и магнитобиологии и может быть использовано в микробиологии при культивировании бактерий 1 п чего и в медицине при усовершенствовании методов диагностики.Известны способы определения метабиолической активности бледной трепонемы, прямым образом связанной с ее патогенностью, т 1 о подвижности, прочности прикрепления к клеткам тканевой культуры и т.д,Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения степени патогенности бледной трепонемы, включающий приготовление. взвеси бледных трепонем в физиологическом растворе и условную количественную оценку степени патогенности (по длительки ферритграната и определяют с помощью микроскопа с фоторегистрами веер колебаний изображения трепонем относительно точки их фиксирования на магнитной пленке. Величина угла раскрытия веера колебаний коррелирует со степенью патогенности бледной трепонемы,.Каплю препарата наносят на рабочую поверхность магнитной пленки ферритграната толщиной 2 мкм, нанесенной на поверхность прозрачной пластины, накрывают покровным стеклом. Выдерживают 5 мин, визуализуют в микроскопе с фоторегистрацией изображения при выдержке 60 с, На полученном изображении путем геометрических измерений определя ют средние параметры веера колебаний препарата бледной трепонемы и оценивают ее патогенность. 1 пр,ности инкубационного периода при инфицировании кроликов).Однако данный способ Оп ччо) характеризуется сложностью, так как предусматривает проведение инъекций и наблюдение за развитием поражений (орхитов и шанкров), достаточно длителен, так как минимальная продолжительность инкубационного периода при заражении сифилисом 20 - 30 сут,Кроме этого, предусматривает затраты на приобретение подопытных животных и их содержание. При этом в случае построения калибровочной кривой необходимо использование не менее 30 кроликов,Целью изобретения является упрощеие способа, его ускорение за счет сокращеия количества подопытных, животных и затрат на их содержание.Сущность предлагаемого способа заключается в том, что, как было установлено,патогенные трепонемы (в свежих препаратах), помещенные на поверхность магнитной пленки ферритграната (МПФГ), в 5отличие от непатогенных или культуральныхтрепонем, прочно. фиксируются дистальныммагнитомаскированным (из-за локализациив нем белка - цитохрома) концом на доменной границе МПФГ и совершают прерывистые колебайия относительно точкификсирования под действием выталкивающей силы постоянного магнитного поля(ПМП) соседних доменов, характеризующихся противоположной направленностью 15векторов намагниченности, При этом ониобразуют веер колебаний площадью Яь,фиксируемый при фоторегистрации,Под влиянием ПМП бледные трепонемыраскручиваются и удлиняются в связи с повышенной магниточувствительностью фибриллярного аппарата, так чтотр (МПП)(длина трепонемы на МПФГ)Ьр(КПР)(дли.Специфика воздействия постоянного магнитного поля на бледную трепонему выражается в прерывистости движения (подобно часовым стрелкам), благодаря чему как веер, колебания Яь, так и число положений (остановок) трепонемы фиксируется при флоторегистрации с выдержкой длительностью т. Чем более патогенна бледная тре 30 понема (метаболически более активна), тем больше угол раскрытия аь веера.Определение степени патогенности бледной трепонемы проводят на магнитных пленках одного типа (с воспроизводимыми параметрами), сохраняющих свои свойства более одного года, т,е, пригодных для многоразового использования в воспроизводимых условиях, При этом пробу препарата,содержащего бледные трепонемы, наносят на поверхность МПФГ, накрывают покровным стеклом и проводят визуализацию трепонем .с последующей фоторегистрацией и определением площади веера колебаний бледной трепонемы относительно точки ее закрепления на магнитной пленке по длине трепонемы и углу раскрытия веера и рассчитывают по формуле параметр(г) ьпвт и у 50 где Яь - площадь веера колебаний бледнойтрепонемы. на поверхности МПФГ 55ь 4,5 ф 10 з аь( - -)г,где а- угол раскрытия веера;Ьр - длина трепонемы; ны трепонемы в контрольном препарате(КПР).на обычном стекле), 25 п 1 - оптическое увеличение при визуализации и фоторегустрации в темном поле микроскопа;и - число дискретных положений при фоторегистрации;т - длительность выдержки при фоторегистрации,Усредненную величину А пзт,находятР)путем обработки изображенйй не менее 200 особей, содержащихся в препарате,Поскольку величина параметра А пэт(г) коррелирует со степенью патогенности бледных трепонем, содержащихся в препарате, то она может быть использована для определения степени патогенности .бледной трепонемы в иследуемом препарате (выраженной, например, в длительности инкубационного периода после заражения кроликов), на основании предварительно полученной калибровочной кривой.П р и м е р, В качестве предметной подложки в процессе определения степени патогенности бледной трепонемы в препаратах используют прозрачную пластину, на рабочей поверхности которой нанесена МПФГ толщиной 2 мкм,Штамм патогенных трепонем или серум, взятый от больного, разбавляют физиологическим раствором или средой 199 в растворе Хенкса так, чтобы исходная концентрация бледных трепонем составляла 1000 - 1500 особей.Пластину с нанесенной на ней магнитной пленкой укладывают на предметный столик микроскопа Биолам Р 17 рабочей стороной кверху.Каплю препарата объемом 0,02 - 0,03 мл с помощью мерной микропипетки переносят на поверхность МПФГ, после чего ее накрывают покровным .стеклом и выде рживают 5 мин, затем проводят визуализацию бледных трепонем с одновременной фото- регистрацией изображения при выдержке 60 с,Патогенными трепонемами считают те трепонемы, которые совершают колебательные движения относительно точки фиксирования, сопровождающиеся образованием характерного веера при длительной выдержке (тьп 1 о не.менее 60 с),Непатогенными трепонемами считают те трепонемы, которые не совершают колебательных движений в магнитном поле МПФГ.После фотосъемки определяют путем геометрических измерений угла раскрытия веера аь, длине бледной трепонемы Ьр и количество положений при колебании и при1742332 Составитель Д.Федорова .Техред М.Моргентал Корректор О.КравЕиа Редактор И,Дербак Заказ 2262 Тираж . . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 рассматривании изображения бледной трепонемы на поверхности МПФГ.Далр определяют расчетные параметры Яь, А пвт и Апат по приведенным выше формулам.Корреляцию количественного показателя А . т проводят путем сопоставления с(2длительностью, инкубационного периода заражения кроликов и величиной шанкров.Степень патогенности бледных трепонем в данном случае зависит от времени хранения препаратов в 2 стандартных условиях. Так, показатель Апат в свежих препаратах после 1-2-суточного хранения находится на уровне 20 - 15 10 мкм с; после 5-10-суточного хранения степень патогенности снижается в 2,5 - 3 раза,Те препараты, в которых содержйтся 50 - 70 трепонем со степенью патогенности 15 - 20 102 мкм 2 с 1, дают минимальный срок заражения и ярко выраженные шанкры величиной более 3 см,Таким образом, изобретение позволитизучать на популяционном уровне эпидобстановку и прогнозировать течение эпидемического процесса.5Формула изобретения Способ определения патогенностибледной трепонемы, включающий приготовление суспензии исследуемой культуры 10 в физиологическом растворе с последующим ее тестированием и количественной оценкой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа, исследуемую суспензию наносят на поверхность магнитной 15 пленки ферритграната, накрывают покровным стеклом и проводят микроскопическое исследование с фоторегистрацией изображения, а оценку ведут по величине площади веера колебаний бледной трепонемы отно сительно точки ее закрепления на магнитной пленке, которую рассчитывают по длине трепонемы и углу раскрытия веера,