Способ получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий и шигелл

(1 Ю (И) 3%О 1 УЬЛИК 1) С 12 М 1/20//(С 21 1:70) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМпб ВКЮПВЕн и рвПРИ ГКНТ ССОф САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ тся в полу этого с р уры, как н повторяя снова реве слизистые(53) 576,8.093.1(088.8)Ьб) Федорова З.Ф, Влияние образованиясферопластов и последующих реверсийна вирулентность и другие биологические признаки Е,со 1 0124:К 72(В 17) жмэи, 1977, )1 7, с. 7-11;Ь 4) спосОБ получения слизистых ФОРМЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ЭШЕРИХИЙ И ШИГЕЛЛ(57) Использование: медицина, ветериИзобретение относится к способам выделения микроорганизмов и может быть использовано для получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий (ЭПЭ) и шигелл.Известен способ получения слизистых Форм ЕвсЬегсЬха со 11 0124: К 72, заключающийся в приготовлении таких питательных сред, как амииопептидный бульон (АПБ), аминопептидный агар 1,5 - 2,0 (АПА среда с пенициллином (АПБ + 20 Ж сахарозы + 0,2 МЕ 80,)+ +12 цц ЕД/мл пенициллина минимальная среда (ННРО1 гю КНРО,) 1 гф На 80 0,2 г, МЕБ 04 1 г, глюкоза 5 г, НО " до 1 л, рН 7,2-7 4, АПА + + 13 пептона (АПА с пептоном) Первый этап способа заключается в получении пенициллиновых сферопластов, Для это-. го исходную К-форму Е,со 1 0124:К 72 выращивают на АПБ и в логарифмической Фазе роста вносят в среду с пенициллином на 3-4 ч .при 37 С, Сферопласты получены. 2нария, бактериологическая диагностика кишечных заболеваний. Сущность изоб" ретения: культуру энтеропатогенных Е,со 1 или шигелл в К-форме высевают на поверхность плотной селективной питательной среды, в которую предварительно внесена суспензия фага Т) в концентрации 10 - .10 БОЕ/мл. Посевыт 9инкубируют в течение 1 сут. при 37 С. Выросшие слизистые колонии пересевают для получения чистой культуры, Слизис" тые формы образуются у всех 56 изученных штаммов энтеробактерий. 2 табл. Второй этап заключается в осущест влении реверсии, т.е. сферопластыследует вернуть в исходную К-форму(ревертанты). Для этого О,1 мл взвесисферопластов вносят в минимальную среду с последующей инкубацией при37 С в течение 1 сут, после чего куль туру выдерживают при 28 С 23 сут,При этом сферопласты превращаются в исходную Е-форму, обозначенную как ревертант. Для их выделения в виде изолированных колоний культуру с ми" нимальной среды. пересевают на АПА с пептоном. Инкубация при 37 С в течение 1 сут. Вырастают изолированные колонии ревертантов - исходная К-форма получена. Затраты времени составляют 4-5 сут.Третий этап заключае че" нии слизистых форм. Для евер- тактами проводят процедпервом и втором этапах, получение сферопластов и р тантов. В лучшем случае фор"317388494мы колоний получают на АПА с пепто- рацией 5 10 КОЕ/мл в объеме 0,1 млном после проведения 4-7 циклов ре- засевают шпаделем на селективную среверсий; Таким образом, слизистые фор- ду АИА+Т Через 1 сут инкубации примы появляются минимум на 16"20-е сут С вырастают слизистые колонии в ко"ки. Выделение в чистой культуре тре- личестве 40-60 на чашку,бует еще 1 сут. Суточную бульонную культуру Е,со 11Известный способ характеризуется 0124:К 72 в исходной К-Форме с кон"сложностью, трудоемкостью и большими центрацией 5"108 КОЕ/мл в.объемевременными затратами.1 О 0,1 мл засевают шпаделем на селективЦелью изобретения является упроще- ную среду КА+Т, Через 1 сут инкубание способа. ции при 37 фГ вырастают слизистые колоПоставленная цель достигается пу- нин в количестве 40-60 на чашку.тем посева взвеси исходной К-формы Суточную бульонную культуру .Е.со 11.ЭПЭ и шиггел на плотную питательную 15 0124:К 72 в исходной К-форме с концентсреду, содержащую бактериойаг Т с по- рацией 5 х 108 КОЕ/мл в объеме О, млследующим выращиванием в течение засевают шпаделем на селективнуюсут при 37 С и выделением появляю.- среду ЭНДО +. Тз, Через 1 сут инкуощихся слизиСтых форм колоний в чистой бации при 37 С вырастают слизистыекультуре. 20 колонии в количестве 40-60 на чашку,П р и м е р. Получение слитистых Суточную бульонную культуру Е.со 11Форм ЭПЭ и шиггел по предлагаемому 0143 в исходной. К-форме с концентраспособу. цией 5 1 Оф КОЕ/мл в объеме 0,1 мл за Изучение литических свойств фага севают шпаделем на селективную средуТз, проводили методом "стекающей кап-. 25 АПА + Т, Через 1 сут инкубации прили" на засеянных газоном культурах 37 С вырастают слизистые колонии в коЭПЭ и шигелл. личестве 20-30 на чашку,Результаты приведены в табл. 1. Суточную бульонную культуру ЗЫ.- Как видно из приведенных в табл. 1 Ве 11 а эоппе 1 в исходной К-форме с кон"результатов, Фаг Т избирательно лизи- центрацией 5 1 Оф КОЕ/мл в объемерует К-формы и не влияет на М-варианты 0,1 мл засевают шпаделем на:селектив-бактерий . По-видимому, это связано с ную среду АПА+Тэ . Через 1 сут инкубатем, что фаг Тэ адсорбируется на бо- ции при 37 С вырастают слизистые кололее коротких цепях липополисахарида нии в количестве 100-120 на чашку.(ЛПС) К-форм энтеробактерий и не мо- Суточную бульонную культуру 8 Ь.жет крепиться на специфических поли Г 1 ехпегд 1 а в исходной К-форме с кон-.сахаридных цепях М"вариантов микробов. центрацией 5ОЙ КОЕ/мл в объемеПродуцируемая М-клетками слизь экранн,1 мл засевают шпаделем на селективрует рецепторы фага Т, свободные у ную среду АПА+Тз. Через 1 сут инкубашероховатых бактерий. ции при 37 ". вырастают слизистые колоЭти данные подтверждают возможность фф нии в количестве 5-10 на чашку.использования фага Т для реализации Способ испытан на 40 Жтаммах Е.соспособа получения слизистых Форм как 11 0124:К 72, 2 штаммах Е,со 1 а 0143,единственного селективного агента в 12 штаммах 8 Ь,воплей и 2 штаммах БЬ.качестве компонента питательной среды. Г 1 ехпег 1 1 а.Приготовление селективной пита Сводные результаты испытаний приветельной среды. дены в табл. 2.В расплавленный и остуженный до Как видно из приведенных в табл. 243 рС АПА добавляют бактериофаг Т в результатов, выход слизистых форм.конечной концентрации примерно О -, . составляет 100 поскольку иэ всех изу0 БОЕ/мл, после чего разливают .по5 ченных 56 штаммов, взятых в К-формечашкам Петри. Среда АПА+Т получена. ЭПЭ и шигелл, удалось получить полоВместо АПА может быть использован ка- жительный эффект,зеиновый агар (КА), среда ЭНДО и дру- Можно добавить, что повышение конгие среды, не ингибирувщие литические центрации бактерий эа счет осаждениясвойства бактериофага. 55 путем центрифугирования исходнойПолучение слизистых Форм. бульонНой культуры или сбора их уро.Суточную бульонную культуру Е.со 11. жая с агаризованной среды (исходная0124:К 72 в исходной К-Форме с концент- К-культура может быть выращена наРТаблица 1 Литическаяактивностьфага Тз формаколоний Числоштаммов Вид исеровар 40 12 г е В вевееевваеевее Таблица 2. ееевет ввв ее еееввевв ее Вид и Числосеровар штаммовтетевеетвфЕ,со 1 д 2.0143 40Е, со 11 Частота получения Иеформ Селектив" ная среда л 5110.-110 ав Составитель А. ВоскресенскийРедактор В. Петраш Техред Я,Моргеитал Корректор С. Шекмартатте т а в аеааав вевеаеееевеаеаееавввтЗаказ 1977 Тираж . . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж-.35Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат патент", г.ужгород, ул. Гагарина,301 5 173плотной среде, а также длительнаяинкубация исходной К-культуры в бульоне, например до 3 сут,ведет к накоплению слизистых .форм в популяции и,как,следствие, к повышению эффектив,ности отбора. Однако это практическине требуется, если речь идет о получении 3-5 колоний (субштаммов)слизистой формы, а не о выделении десятковИеклонов из одной Кткультуры,Проведенные исследования позволяютсчитать, что способ может быть использован для получения слизистых формЭПЭ и шигелл Е,соИ0143Е, со 10124ЗЬ, 80 ПпеЗЬ.Ю 1 ех"пет 1 1 а 8849 6 формула изобретения Способ получения слизистых формэнтеропатогенных эшерихий и шигелл путем посева культуры в Ктформе на питательную среду с последующим инкубированием посевов и выделением еистой культуры слизистых форм бактерий, 10 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения способа, посев культуры в Кеформе осуществляют на питательную среду с бактериофагом Тз,И, Нет лиэисаК ЛизисИ Нет лиэисаК . ЛизисИ Нет лизисаК ЛизисИ Нет лизисаКЛизис.