Способ консервирования постоянных клеточных линий

(51)5 С 12 й.5/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2 табл.(71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР(56) Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков .А.А. и др. Культура клеток и тканей животных, Ставрополь: Ставр. с /х институт, 1980, с, 110.Авторское свидетельство СССР М 1398203, кл, А 01 й 1/00, 1987.Авторское свидетельство СССР М 1192762,кл, А 01 й 1/00, 1985.Авторское свидетельство СССР ЬЬ 888896, кл. А 01 й 1/02, 1981. Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур.Известные способы консервирования клеточных культур имеют ряд недостатков; требуют отмывания криопротекторов, основаны на применении неустойчивых при хранении криопротекторов или криопротекторов, полученных лабораторным синтезом в небольц 1 их количествах.Наиболее близким к данному является способ консервирования клеточных культур, включающий замораживание их в присутствии 10 ДМСО по двухэтапной программе: до -300 С со скоростью 10 С/мин; затем до -70 С со скоростью 4-6 С/мин с последующим помещением в жидкий азот на хранение.(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ПОСТО ЯНН ЫХ КЛЕТОЧ Н ЫХ ЛИНИИ (57) Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур, Цель изобретения - упрощение процесса консервирования клеточных культур. Для этого в способе консервирования постоянных клеточных линий, включающем замораживание в присут- ствии криопротектора на первом этапе до -30 С, на втором со скоростью 5 град/мин до -70 С с последующим погружением в жидкий азот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1:2-1:5 со скоростью замораживания на первом этапе ОД - 0,4 град/мин. Недостатком этого способа является необходимость отмывания клеток от криопротектора, что значительно усложняет процесс консервирования. Кроме того, ДМСО неустойчив при хранении: разлагается с образованием серосодержащих продуктов, обладающих резким неприятным запахом. Срок хранения до 1 мес.Цель изобретения - упрощение процесса консервирования.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу консервирования постоянных клеточных линий, включающему замораживание в присутствии криопротектора на первом этапе до -30 С, на втором со скоро- стью 50 С/мин до -70 С с последующим погружением в .жидкий аЗот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1:2 - 1:5 соскоростью замораживания на первом этапе 0,2 - 0,4 С/мин.Криоконсервант пропандиосахароль содержит пропиленгликоль (1,2-пропандиол) 360 г, сахарозу безводную 32 г, натрий хлористый 6 г, воды для иньекций до 1 л, Криконсервант обладает низкой токсично- стью и устойчив при хранении до 2 л, ЛДпропандиосэхароля серии 050186 для белых беспородных мышей 15,4 (14,0 - 17,0) г/кг, через 2,5 г хранения ЛД-15,6 (14,0 - 18,0) г/кг. Разработана технология на получение готовой стерильной лекарственной формы пропандиосахароля и нормативно- техническая документация (ВФС). П р и м е р 1, Сформировавшийся моно- слой клеток постоянной линии почки теленка (ПТ в хорошем состоянии (клетки эпителиоподобного типа с четко выраженными границами) снимают с поверхности стекла культуральных сосудов смесью растворов версена и типсина в соотношении 4:1 бесцентрифужным методом и берут пробу для определения концентрации и жизнеспособности клеток, К суспензии клеток добавляют криоконсервант пропандносахароль разбавленный питательной средой: 90.- среды 199, 107; сыворотки крупного рогатого скота и 100 мкг/мл канамицина сульфата, до конечного разведения 1;3,5 и концентрации клеток 1,9 х 10 /мл, Клеточйную суспензию разливают в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл и запаивают. Зквилибрацию клеток с криозащитной средой осуществляют 15 - 20 мин при комнатной температуре, Охлаждение проводят в программном замораживателе нэ первом этапе со скоростью 0,3 С/мин до -30 С, на втором со скоростью 5/мин до -70 С, после чего погружают в жидкий азот (-196 С) и хранят 20 дн, Отогреваот в водяной бане при 37 С, Размороженные клетки переносят в культуральные флаконы, добавляют питательную среду ц 5 о посевной концентрации клеток 1,9 х 10 /мл. Культивирование осуществляют при 37 С без замены среды через сутки. Жизнеспособность размороженных клеток определяют методом суправительного окрашивания раствором типанового синего, которая .составила 80,0. По истечении 4 сут культивирования образцов монослой выполнен на 100поверхности культурального флакона. Клетки имеют полигональную форму с хорошо вы 5 10 15 20 .Р 25 30 35 40 4 50 55 раженными границами, В цитоплазме отсутствуют видимые признаки цитопэтологии,П р и м е р 2. Способосуществляютаналогично примеру 1 на клетках постоянной линии карцинома гортани(Нер). Замораживэют в криоконсервирующих средах сразличными разведениями пропандиосахароля 1;1; 1:1,5; 1:2; 1:3; 1:3,5; 1: 5; 1.6, Самая высокая жизнеспособность клетокобеспечивается при разведении пропандиосахароля 1;2 - 1:5, На 4-е сут культивирования монослой этих образцов выполнен на100 фклетки имеют полигональную формус четко выраженными границами, в течение3 пассажей хорошо снимаются со стекла ипересеваются. Образцы, консервирован-,ные при разведении пропандиосахароля1;1; 1:6, при культивировании образовывают островки на поверхности культуральныхфлаконов и не пассируются.П р и м е р 3. Способ. осуществляют.аналогично примеру 1 на клетках постоянных линий Нери ПТ. Замораживание напервом этапе осуществляют с различнымискоростями 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 5,0 С/мин.Жизнеспособность клеток Нери ПТпосле замораживания с различными скоростями на 1-м этапе (п=8) приведена в табл.1.Из табл.1 следует, что для клеток Нер оптимальными являются скорости 0,2 -1,0 С/мин, Для клеток линии ПТ этот интервал уже 0,2 - 0,4 С/мин, Поэтому отобранинтервал 0,2 - 0,4 "С/мин,П р и м е р 4, Способ осуществляютаналогично примеру 1 с клетками НериПТ. Параллельно консервируют клетки известнь,м способом.Жизнеспособность клеток Нери ПТпосле замораживания различными способами на 1-м этапе (п=8) приведена в табл.2.Из табл.2 следует, что жизнеспособность клеток, консервированных предлагаемым способом, такая же, как и в известном.формула изобретенияСпособ консервирования постоянныхклеточных линий путем замораживания их вприсутствии криопротектора на первомэтапе до -30 С, на втором со скоростью5 град/мин до -70 С с последующим погружением в жидкий азот, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса,замораживание осуществляют с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1;2 - 1:5, а скорость замораживания нэ1 этапе 0,2 - 0,4 град/мин.1708835 Таблица 1 Та бл орректор М,Шарош едактор А,Долинич ЗаказВН Составитель А.Романченехред М.Моргентал Ъ Тираж Подписное ПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКН 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101