Способ определения адгезии лейкоцитов

(19) ,г Ъ-з,11) М 8 ,"11 М 33/ ТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(22) 09.11,89 (46) 07,12,91. Бюл. М 45 (71) Институт иммунологии (72) 1 У 1.З.Саидов и Б,В,Пинегин (53) 615,375 (088,8) (56) Пинегин Б.В., Ковальчук Л,В., Еремина О.Ф, С. андартные методы иммунологического обследования по тестам первого уровня, 1 У 1 етодология, орГанизация и итоги массовь)х иммунологических обследований. - М 1987, с. 234 - 243, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к клиническойиммунологии, а также для диагностики специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц, Целью изобретения является повышение точности способа. Способ осуществляют путем инкубирования цельИзобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике специфической сенсибилизации лейкоцитов у обследуемых лиц,Целью изобретения является повышение точности определения адгезии лейкоцитов крови.Способ осуществляют следующим образом.Лейкоцитарную взвесь из цельной гепаринизированной крови получают путем осаждения эритроцитов 0,9 - 1,1;4-ной жела- тиной на среде 1199, Выдерживают смесь 10 - 15 мин при 37 С, Отбирают надосадок, Суспензию, находящуюся в надосадочной жидкости, отмывают в режиме 200 д в течение 10 мин и 0,05 -0 15 мл клеточной взвеси ной крови с 0,9 - 1,1%-ным раствором желатлны на среде 199 в течение 10 - 15 мин с последующим выделениек 1 лейкоцитов. Полученну.о суспензию лейкоцитов из надосадка осажда 1 от и вносят в лун) и планшета в концентрации 1-1.5 млн/мл ядросодержащих клеток в среде 199, затем клетки ин. кубируют 1,5 - 2 ч при рН 7,0-7,2 с после - ющей промывкой и дозированием, Определенле адгезии пооводят по активности миелопероксидазы в прилипших клетках, Для этого в лунки пганшета дополнительно вносят смесь ортофенилендиамина и перекиси водорода в соотношении (98-102):1, после чего снимают показатель оптической плотности, пропорционально соответствующий количеству прилипших клеток. Способ является значительно более точным, Положительный эффект способа дает возможность значительно повысить точность метода и сокоатить время его выполнения,на среде 199 в концентрации 1 - 1,5 млн/мл помещают в лунки плоскодонных пластин для иммунолог 1)ческих реакций, Пластины предварительно обрабатывают средой 199 в течение 30 мин,Планшеты инкубируют в течение 1,5 - 2 ч при 37 С в присутствии 5;ь СО 2, или буферного раствора(ХЕПЕС) для создания рН 7,0 - 7,2, По окончании инкубации содержимое лунок трижды промывают средой 199 и последний раз бесцветным физиологическим раствором (рН 7 - 7,2) для удаления остатков красителя,Количество прилипших клеток определяют путем тестирования активности фермента 1 У 1 П, содержащегося в азурофильных гранулах этих клеток, С этой целью в лунки( Н 202, при их соотношении 11303;. ) - са 1(ОРД на фосфэт-Ц 3 лтратнс 3 м бч 328 О. ", 5;,1По истечении 5 - 10 млн ривак 332331 сстрнав.3,вается добавлением 1 4 Н 2 ЛО 4, оп гр 1:веку:оплотность реакционно 3;М 8 си снима,д"м н О Г О к а н а л ь н О м с Г е к т О с ф Г о ,:, ,е -,:, аМ 3)3 т 3 заг Р 1)з, Резульгаты 83 .:Ческ.:рП Л ОТ Н ОСТИ, С От В ЕТСТ аук) ВИ а ".;"; л -, г, Ь О Сгтисследуемой МП В прилип 33 гр 1 х клет".Вх 3)ес 1",- ВОдят В ус.ед, активно тя ф 83"., 18 нте пеос"."сидазы хрена удельная 83:тиарс 1 ст".",с 3-5%:ед/мг).Для построения стансаз. Ной калибровочной криво 3 л используется и О 3 От овл а,- 20ный раствор перекспдазы :;:,ена сизВестной кОнцентоеци 8 Й зтоГС с."ерме та хактивность этОГО феомента ге ты)уется втой же реакционнол С 3 лс.евое, Ств. Д 11 Г 33-у 3 скривую С 1 роя 3, Откладывея 3 э ос 4 р. зосцрСс .ивесовые количества 338 ос 1 К 3:, 1,:азы хпе-в, апо оси ординат соответст.;ус.ну 8 3,.". Оп-,ЧЕСКУЮ ПЛОТНОСТЬ,Объектом исслег оваж.Я слу)хрГепар, - 33низирОВанная кровь, пс 1 луч 8 н-,3 я:1 з Ве;- - вколичестве 10 мл. Далее полу 38 ь 33-,у 3;1 кровьделят на 10 Г 3 орци 3 л помл,: провс,.с 1 ят 10параллельных исследова 31 ий, С 338 ль 3 о раз.деления клетск белой ровл от 83)3 лтрс 1 Ц;,товкровь смешизают с О,с,.-Ным:.;.Яс.31 с,п)гжелатина на питательной соеде 3",с 1 В: ношении 1:2. Инубр 1 ру 3 с 3 т в течен.18 10 м 1 нпри Д 7 С По ис 1 ече р и ы 6 ку 1 с 38," г 1ВВВШИЙСЯ Вео 1 НИЙ СЛОИ СОСТОЯ 3",1,ъы;,Щ 8 СТВЕННО ИЗ ЛЕЙКЗЦР 1 О,"-, З)С;1 да 3 ГГГ ИОтмывают От желатина ппр 1 1 г 10течение 10 мин.После отмывания к,;ле 3 пам д)бав 13 Я с)тмл среды 199 или:бас;:-.Нср 1 рсВен)ого сс 1- д 5левого раствора. П 33)аводят;:че-. 3 т 3 атзккраске следу 1 ащего составе, %: Грч 3 то 3-Х.100 0,2, зозин 0,1; азур 11 Вог 3 орас"-сг 33;,3 м 3 ы,:,0,015), Г 32 О ДО 100раза с 1 ение Я 8 ГГ 3 чнойсусп 8 нзии , 30),Дифверанц 3 лрованнь 3 й счет проводт вкамере Г 1 ряева с, учетом формы ядра, чтоГ 1 ОЗВСЛЯЕТ ВВЕСТИ ПРОЦЕНТ ПОЛИНУКЛ 8 ЭРН 3,. " 3 Г мон)нуклеаг 3 Нь х клеток, наояду с аб.:Олютным (с 3 лр 1 цество лейкоцитов и:.Ей ГРОфИ 3 ОБ,В Г 3 у 3-3:р 1 плоскодонных и.1 анш 8 т для иммунолОГичесИх оеакцлй вносЯт 0,1 мл ис.Ледуемой клеточнОй взвеси с концентра,ай 1 10 нейтроф 3 ллов КЗЛ, Далее планше) 3 Я ы 3 Куб 3 лрм,о Б теч 83 Л 18 15 ч при 37"С Впвнсутствии 5% "О 2 По окончанли инкуба 33,.ы 3 Л СОДВРжИМОЕ ЛУНОК тРИжДЫ ПРОМЫВаЮтори,"ой .;,ь р 1 последний Оаз б 8 сЦэетным11 ыс 3 р 1 оло 3.лче. Ким раствором рН 7,0 для удаления остатков красителя, Затем в лункидобавляю- О,3 мл Н 2 О, выдерживают в течение 20 мин и;.елее вносят в лунки 0,1 мл смеси,0.04% ортофенигендиа 3 1 ина на фосфат-цитратном б 1)еое рН 5,0 и 0,02% раствораН 7 2 при их соотношении СООТВ 8 тств 8 нноОевном ".03 Р в 10,2 мл ОРД ВносЯТ 0,1 мл0 02 с; Н;О 2) -ерез 5 мын оеакц 31 т Останавливается добавлением 0,1 мл 1 3 Ч Н 2 ЬО Оп"ическую плотность реакционной смеси.; 3 имают в ,пект 3)офо т о 3" етре "31 с 3313 В 33 апР с 3 з",Сраенитальнь 3 й анализ предлагаемогои известного способов г 1 риведен в таблице. Ооом ла изобретения Сгособ 3 Пределеныя адгезии лейкоци- тОВ, ВКЛЮЧаК. 33 ЦИР,Х ВЬДЕЛЕНИЕ И ПОСЛЕДУЮДве эпредетеые количества приллпших к повеохнос.ты пластике;леток, о т л и ч а ю 3 ц" й с: я тем, То, с целью повышения гсЧ 3-осты сп особа. суспензлю лейкоцитов вносят лунки г 1 ланшета в концентрации 1-5 31 л 33,мл г ей о цито в, лн кубируют 1,5 - 2 3 г" ри рН 7,0 7,2 с последуОЗЦВЙ промывкой 1 ллзирован ем, а адгезыю определяют по активности миелопероксидазы в прилипших клетках, при атом в лунки дополнительно вносят смесь О,О 4% раствора о)Тос)8.Иле( диамина и 0,02% раствора пе- ПВКИСИ ВОДО)ОДВ В СООТНОШЕНИИ СООтВЕтСтзаико равном 398;102):1, после чего снимают показатель с гти-:еской плотности, пропор 3 ыональносответствующий количестВу при)1 ип 3 ц:"х 3:леток,1697008Составитель Б.Мануйлов Редактор В.Бугренкова Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец Заказ 4303 Тираж подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретенилм и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раущскгл наб 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101