Способ радиоиммунологического определения аутоантител к тиреоглобулину

9) ( 681270 А 1 5)5 6 01 й 33 534 ЕИ А Б ТЕН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ. ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Институт биоорганической химии АНБССР(54) СПОСОБ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ КТИРЕОГЛОБУЛИНУ(57) Изобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к радиоиммунологическому определению аутоэнтител(ауто АТ) к тиреоглобулину (ТГ) в сывороткекрови человека. Целью изобретения является упрощение способа. Способ включает инИзобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к радиоиммунологическому определению аутоантител (аутоАТ) к тиреоглобулину (ТГ) в сыворотке крови человека. Определение аутоАТ к ТГ используется для диагностики аутоиммунных тиреоидных заболеваний - тиреоидита Хашимото, диффузного токсического зоба, идиопатической микседемы,Целью изобретения является упрощение способа за счет использования для построения калибровочной кривой в качестве стандартных растворов аутоАТ к ТГ растворов кроличьих АТ к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека. кубацию исследуемой пробы с раствором меченого йодом - 125 ТГ, внесение в инкубационную среду АТ к имуноглобулинам человека, повторную инкубацию, центрифугирование, радиометрию осадка и определение концентрации аутоАТ к ТГ по калибровочной кривой. Особенностью способа является использование в качестве стандартных растворов для построения калибровочной кривой растворов кроличьих АТ к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека. ДиапазЬн определяемых концентраций аутоАТ к ТГ составляет 0,5 - 25 мкг/мл, чувствительность -0,5 мкг/мл, общее время анализа - 4 ч. Результаты клинической апробации способа свидетельствуют об упрощении его применения в медицинской практике. Используют калибровочные кривые, Я получаемые с помощью заявляемого спосо- ь ба при использовании в качестве стандартных растворов кроличьих АТ к ТГ, конъюгированных с иммуноглобулинами человека, и растворов аутоАТ к ТГ; совпадение калибровочных кривых свидетельствует о возможности использования растворов кроличьих АТ к ТГ, конъюгированных с имму- э ноглобулинами человека в качестве стандартных. Используют данные по восп,роизводимости результатов измерений концентраций аутоАТ к ТГ в сыворотке крови и результаты определения концентрации аутоАТ к ТГ в сыворотке крови здоровых лици больных аугоиммунными 1 иреоиднымизаболеваниями.П р и м е р, Для проведения радиоиммунологического определения аутоАТ к ТГ всыворотке крови человека используютсяследующие реагенты:- ТГ с удельнойактивностью 3 - 6 мкКи/мкг и иммунореактивностью (связывание при избытке АТ кТГ) не менее 85-",ь; препарат- ТГ разбавляют 0,05 М натрийфосфатным буфером,рН 7,4, содержащим 0,1 обычий сывороточный альбумин (БСА) и 0,02 чарлз, до такойконцентрации, чтобы в 100 мкл содержалось 7 - 10 нг меченого ТГ.Стандартные растворы ауто к ТГ - вкачестве стандартных растворов используются растворы кроличьих антител к ТГ,конъюгирован ных с иммуноглобулинами человека, в сыворотке крови человека, эквивалентные следующим концентрациям аутоАТк ТГ: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 10; 25 мкг/мл.Иммуносорбент - 10 раствор козьихАТ к иммуноглобулинам человека, иммобилизованных на бактериальной стенке золотистого стафиллококка,Буферный раствор - 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1%БСА и 0,02 очарлз,Проведение анализа.1. Пробирки для анализа (в дубликатах)маркируют следующим образом; Т - общаяактивность- ТГ, Вн - неспецифически125связанный- ТГ, С 1 - С 5 - стандартные125растворы аутоАТ к ГГ соответственно 0,5 -25 мкг/мл, Сх - исследуемые пробы сыворотки крови,2. В пробирки Вн вносят по 10 мкл стандартного раствора "0 мкг/мл", В пробиркиС 1 - С 5 вносят по 10 мкл соответствующихстандартных растворов. В пробирки Сх -вносят по 10 мкл исследуемых сыворотоккрови.Исследуемую сыворотку крови с концентрацией аутоАТ к ТГ более 25 мкг/млнеобходимо развести "нулевым" стандартным раствором 0 мкг/мл),3, Во все пробирки, кроме Т, вносят по100 мкл буферного раствора.4. Во все пробирки вносят по 100 мкл125- ТГ,5. Пробирки закрывают пробками, содержимое каждой пробирки перемешиваютна вихревом смесителе и инкубируют пробирки в течение 2 ч при 37 С.б, Во все пробирки, кроме Т, вносят по250 мкл иммуносорбента. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают навихревом смесителе и инкубируют пробирки в течение 1,5 ч при комнатной температуре.35 40 45 50 55 5 10 15 20 25 30 7, Все пробирки, кроме Т, центрифуируют при 1500 -2000 9 в течение 15 минут8, Удаляют надосадочную жидкость спомощью водоструйного насоса, избегая захватывания осадка,9. Во все пробирки, кроме Т, вносят по1 мл буферного раствора, содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают навихревом смесителе и центрифугируют пробирки согласно и, 7,10. Удаляют надосадочную жидкость согласно и. 8.11. Все пробирки помещают в гамма 125счетчик и измеряют скорость счетавкаждой пробирке в течение 1 мин.Расчеты и графические построения.Находят средние арифметические значения скоростей счета для каждой пары пробирок, Из полученных значений скоростейсчета, кроме значения скорости счета дляпробирок Т, вычитают среднее арифметическое значение скорости счета в пробиркахВн (неспецифически связанный- ТГ). На- 12основании полученных значений скоростейсчета (В) рассчитывают величину В 100/Тдля каждого стандартного раствора и исследуемой пробы.Строят калибровочную кривую в полулогарифмических координатах, откладывая на оси ординат (линейная) значения Вф 100/Т, а по оси абсцисс (логарифмическая)- значения концентраций аутоАТ к ТГ в мкг/мл в соответствующих стандартных растворах. Для исследуемых проб на основании соответствующих значений В 100/Т определяют по калибровочному графику концентрацию аутоАТ к ТГ Упрощение известного способа дости гается использованием для построения ка либровочной кривой в качестве стандартных растворов кроличьих АТ.к ТГ, коньюгированных с иммуноглобулинами че ловека, т.е. доступных в больших количест вах компонентов. Доступность стандартных растворов делает возможным широкое при менение заявляемого способа. Заявляемый способ также как и извест ный способ характеризуется высокой точностью, о чем свидетельствуют низкие значения коэффициента вариации результа тов определения концентрации аутоАТ к ТГ Результаты определения аутоАТ к ТГ в сы воротках крови здоровых лиц и больны. аутоиммуными тиреоидными заболевания ми с помощью заявляемого способа соо 1 ветствуют данным литературы ь свидетельствуют о возможности примене ния способа в медицинской практике.Формула изобретения Составитель БонарцевРедактор Л,Веселовская Техред М,Моргентал Корректор Н.Король Заказ 3311 Тираж 388 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауаская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Способ радиоиммунологического определения аутоантител к тиреоглобулину путем инкубации сыворотки крови с 5 раствором меченого йодом - 125 тиреоглобулина, внесения в инкубационную смесь антител к иммуноглобулинам человека, повторной инкубации, центрифугирования, отделения осадка и его радиометрии с по следующим определением концентрации аутоантител к тиреоглобулину по калибро вочной кривой, построенной при использовании стандартных растворов антител к тиреоглобулину, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве стандартных растворов антител используют растворы кроличьих антител к тиреоглобулину, конъюгированных с иммуноглобулинами человека.