Способ количественного определения содержания двуспиральных рнк

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЕНИ ярной елью оба и ряют 05 М 01 М скую С.Н.Загребельный, ынецкий, Б.С,Прохо(72) О.А.БеличенкоТ.И,Котюшева, Е,Ю.ров и В.И.Пупкова(54) СПОСОБ КОЛИДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖНЦХ РНК леазу нчклекцию ержа- привеения, , длил. 1 особ заключается в ле ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ 6, 17, М 1, р. 145-173.ЧЕСТВЕННОГО ОПРЕАНИЯ ДВУСПИРАЛЬИзобретение относится к молекулярной биологии и аналитической химии, а именно к способам количественного определения двуспиральных РНК(дс РНК),Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности.Упрощение способа и повышение точности достигается за счет следующих приемов, одноцепочечные РНК (9 с РНК) в анализируемом образце гидролизуют ферментом 51-нуклеазой (95-115 ед. акт. на 1 о,е, нуклеотидного материала в течение 25- 35 мин), количество дс РНК определяют по разности между исходной оптической плотностью и оптической плотностью определяющей вклад оц РНК.На чертеже показана кинетика гидролиза одно- и двуцепочечных РНК в зависимости от активности фермента 31-нуклеазы и времени гидролиза,С 07 Н 21/02, С 12 Р 19/26 01 й 33/52(57) Изобретение относится к молекулбиологии и аналитической химии. Цизобретения является упрощение споповышение его точности, Пробу раствв буферном растворе, содержащем 0ацетата йа, рН 4,6, 0,05 М МаС 1, 0,0ЕпЯ 04 (буфер А), и измеряют оптичплотность раствора. Затем раствогревают до 45 С, добавляют 31-нукв количестве 95 - 115 ед, акт, на 1 о,е,отидного материала и проводят реагидролиза в течение 25 - 35 мин, Содние дс РНК определяют по формуле,денной в тексте описания изобретТочность анализа составляет 80 отнтельность анализа - не более 2 ч. 1 и Предлагаемый сследующем.Анализируемую пробу растворяют в буферном растворе, содержащем 0,05 м ацетатэ натрия рН 4,6, 0,05 м йаС 1, 0,001 м с.п 304 (буфер А), и замеряют оптическую плотность раствора, Далее раствор нагреваютдо 45 С, добавляют фермент 31-нуклеазу в количестве 95-115 е.э, на 1 о,е. нуклеотидного материала и проводят реакцию гидро- лиза при данной температуре в течение 25 - 35 мин, Содержание дс РКН в нуклеотидном материале анализируемого образца определяют по формулех=(до- - - ") 1 оод, р)кгде Х - содержание дс РНК, о/о;Ао - оптическая плотность раствора, взятого на анализ;А 1 - оптическая плотность раствора пос проведения реакции гидролиза;К - стандартная величича коэффициента гиперхромного эффекта одноцепочечнойРНК, равная 0,420,Точность анализа составляет 8)ь отн.Длительность анализа составляет не более 2 ч,П р и м е р 1. На анализ берут препаратыдс РНК фага о 6, имеющие следующий состав; 10-90 О дс РНК, 10-90 оь одноцепачечной РНК,Из приготовленного раствора препарата дс РНК 1 мг в 4 мг в 4 мл буфера А)отбирают 2 аликвоты по 1 о.е.; в одной изних замеряют точную оптическую плотностьраствора при длине волны 260 нм. Оптическая плотность АО = 0,981, Другую аликвотунагревают до 45 С, к ней добавляют 100 ед,акт. фермента 31-нуклеазы и проводят реакцию гидоализа при данной температуре втечение 30 мин. По истечении времени гидролиза определяют оптическую плотностьгидролиэа при длине волны 260 нм.Оптическая плотность А 1 = 1,270,Содержание дс РНК (х) в нуклеотидномматериале исследуемого образца вычисляют па формуле (1); ано составляет 29,3,П р и м е р 2. Проведение анализааналогично приведенному в примере 1 заисключением того, что время гидролиза составляет 25 мин, а количество добавленногофермента - 95 ед, акт, на 1 о.е. нуклеатидного материала,Оптическая плотность исходного раствора Р Ао = 1,047;Оптическая плотность гидролизатаА 1 = 1,370.Содержание дс РНК в нуклеотидном глатериале составляет 27,0;4,Точность определения 87 О отн.П р и м е р 3. Проведение анализа аналогично приведенному в примере 1 эа исключением гога, что ваемя гидрализасоставляет 35 мин, а количество добавленного фермента - 115 ед, акт. на 1 о.е. нуклеотиднога материала,Оптическая плотность исходного раствора Аа 1,142,Оптическая плотность гидролизатаА 1 =. 1,483.Садержаниедс РНКв нуклеотидномматериале составляет 35,1.Точность определения 8 Д отн.П р и м е р 4, Проведение анализа аналагич о приведенному в примере 1 за исключением того, что время гидролизасоставляет 20 мин,а количество добавленногоо фермента - 100 ед, акт, на 1 о,е. нуклеотиднага материала,Оптическая плотность исходного раствора Ао = 1,040,Оптическая плотность гидролизатаА 1 = 1,330.5 Содержание дс РНК в нуклеотидном материале составляет 35 ф,В этом случае результат получен неправильный, так как не полностью прошел гидролиз одноцепочечной РНК, что привело к10 получению завышенного результата.П р и м е р 5. Проведение анализа аналогично приведенному в примере 1 за исключением того, что время гидролизасоставляет 30 мин. Количество добавленно 15 го фермента 200 ед. акт. на 1 о,е. нуклеотидного материала,Оптическая плотность исходного раствора Ао = 1,030.Оптическая плотность гидролизата20 А 1 = 1,365,Содержание дс РНК в нуклеотидном материале составляет 23;,В данном случае результат получен неправильный, так как частично прошел гид 25 ролиз дс РНК, что привело к занижениюрезультата.Использование предлагаемого методаобеспечивает сокращение времени анализас 5 да 2 ч за счет уменьшения числа стадий30 и времени гидролиза,Кроме. того, данный метод позвоЛяет повысить точность определения, т,к. исключается ряд стадий (фильтрация, осаждение),на которых возможны потери материала,35 Применение изобретения в лабораторных работах и на производствах, связанныхс получением высокоэффективных средствборьбы с вирусными инфекциями, повыситих эффективность и экономичность.40Формула изобретения Способ количественного определениясодержания двуспиральных РНК, включающий растворение анализируемого образца 45 в буферном растворе с последующим спектрофатометрическим измерением оптической плотности образца, гидролизом одноцепочечных РН К ферментом, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения 50 способа и повышения его точности, гидролиз одноцепочечных РНК проводят ферментом Я 1-нуклеазай в течение 25-35 мин при соотношении фермент;нуклеотидный материал 95 - 115 ед, акт,:1 о,еопределяют оп тическую плотность гидрализата иопределяют количество двуспиральных РНК па разности между оптическими плотностями исходного образца и гидрализата.