Способ определения степени повреждения эритроцитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 3549 А 1 09) 3(49, 33/4 55 0 0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗС)БРЕТЕНИ клеток АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР(56) Сапабап Лоцгпа РЬузго 1 оцу апбРпаппасо, 1977, ч.55, М 6, рр.1307-1310.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИПОВРЕЖДЕНИЯ ЗРИТРОЦИТОВ(57) Изобретение относится к биологии имедицине, Цель изобретения - повышениеточности при одновременном расширениивозможностей способа. Суспензию исслеИзобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения степени повреждения эритроцитов после их криоконсервирования или воздействия различных физических и химических факторов, а также при различных заболеваниях.Цель изобретения - повышение точности способа при одновременном расширении еговозможностей,Способ осуществляют следующим образом.Суспензию исследуемых эритроцитов центрифугируют при 30009 в течение 5 мин, затем в надосадочной жидкости спектрофотометрически определяют процент выхода гемоглобина (по отношению к 10070-му лизису). Осажденные в результате центрифугирования клетки ресуспендируют в плазме крови,дуемых эритроцитов центрифугируют и определяют концентрацию гемоглобина в надосадочной жидкости, В контрольном (нативном) образце суспензии эритроцитов определяют распределение клеток по объему. Осадок, полученный после центрифугирования, ресуспендируют в плазме и определяют в нем количество клеток, распределение по объему которых идентично распределению клеток по объему в контрольном образце. Затем определяют степень повреждения эритроцитов в процентах по формуле, приведенной в описании, Способ позволяет снизить относительную погрешность определения степени повреждения эритроцитов и проводить определения в средах, содержащих антибиотики, 4 табл. так как в ней имеются компоненты (белки, липопротеины), способствующие поддержанию нативной формы эритроцитов, Далее в ресуспендированных эритроцитах определяют количество клеток, распределение по объему которых соответствует распределению по объему эритроцитов, предварительно определенному в контрольной (нативной) суспензии эритроцитов,С целью нормировки распределений анализу подвергается всегда одно и то же количество эритроцитов, равное 2шт. Степень повреждения эритроцитов (П) определяют по формуле П =Г+ (100-Г) (1- - ),;4,Мо где Г - пооцент темолиза клеток ИО - количество подсчитанн ресуспендированном осадке.ч 1 - количество клеток, распределениекоторых по объему идентично распределению по объему в контрольном образце,Время анализа 13 - 15 мин,П р и м е р 1, Эритроциты донорской 5крови трижды отмывали физиологическимраствором, содержащим 0,15 М йаС на 5мМ фосфатном буфере, рН 7,4, после чегоинкубировали их в 1,2 М ИаС в течение 10мин, Затем клетки переносили в изотонические условия(0,15 М КаС),пробы центрифугировали 5 мин при 50009, отбиралинадосадок и определяли в нем содержание+гемоглобина и инов К при помощи калийселективного электрода, Процент гемогло+бина и ионов К определяли по отношениюк такому же числу полностью лизировавшихклеток после замораживания до -196 С.Осадок ресуспендировали в плазме крови иопределяли процент повреждения клеток 20согласно предлагаемому способу, Полученные по 5 экспериментам данные представлены в табл,1.П р и м е р 2. Отмытые эритроцитыпомещали в физиологический раствор и инкубировали в течение 1 ч при 50С, Затемпробы центрифугировали и проводили измерение процента выхода гемоглобина иионов К так же, как и в примере 1. Полученные данные приведены в табл,2, 30Из данных, представленных в табл.1 и2, видно, что оценка степени повреждения+эритроцитов по выходу К в обоих случаяхпревышает оценку, осуществляемую по выходу гемоглобина. Оценка степени повреждения, проведенная с помощью предлагаемогоспособа, превышает оценку по выходу калия,что свидетельствует о большей достоверности предлагаемого метода.П р и м е р 3, Б пробирку помещали 1 мл 40трижды отмытой путем центрифугированияпри 50009 в течение 10 мин суспензии эритроцитов (50 оь на физиологическом растворе) и замораживали без криопротектора соскоростью 300 - 400 С/мин в жидком азоте 45доС, Отогрев производили на водянойбане при 42 С.После размораживания образцы центрифугировали при 30009 в течение 5 мин,отделяли надосадок и спектрофотометрически на длине волны 543 нм определяли в немкон центра ци ю с вободн ого гемоглобина.Рассчитывали процент гемолиза эритроцитов по отношению к 100-му лизису, вызванному добавлением к контрольному 55образцу детергента тритона Х - 100 в концентрации 0,5 О. Полученные при центрифугировании осадки ресуспендировали вплазме крови до концентрации клеток 1,5 кд 10 кл/мл, измеряли распределение клеток по объему на приборе СоЫ 1 ег-Соцпсег, Мосе Я. Анализу подвергали 2 клеток как1 зв контрольном. так и в опытном образце, Для контрольного образца брали свежие донорские эритроциты, суспендированные в плазме крови,Данные по определению степени повреждения замороженных без криопротектора эритроцитов представлены в табл,З,Из данных, приведенных в табл.З, видно, что распределение по объему ресуспендированных в плазме эритроцитов существенно отличается от аналогичного распределения для контрольных клеток. Это указывает на то. что в суспензии ресуспендированных эритроцитов значительное количество клеток повреждено, поэтому суммарная степень повреждения, рассчитанная согласно предлагаемому способу, выше, чем степень повреждения, оцененная только по степени гемолиза эритроцитов. Следовательно, дополнительный учет степени повреждения ресуспендированных эритроцитов повышает достоверность определения степени повреждения эритроцитов.П р и м е р 4. Замораживание осуществляли аналогично примеру 3 с той лишь разницей, что среда замораживания вместо физиологического раствора содержала криопротектор ПЭГв концентрации 15. Определение процента гемолиза и распределения эритроцитов по объему измеряли, как в примере 1,Данные по определению степени повреждения замороженных в ПЭТэритроцитов представлены в табл.4.Из данных, приведенных в табл,4, видно что степень гемолиза при замораживании под защитой криопротектора значительно меньше, чем без криопротектора, и распределение по объему ресуспендированных эритроцитов в этом случае значительно ближе к контрольному. Поскольку распределение по объему ресуспендированных эритроцитов отличается от контрольного, в этой популяции клеток есть некоторое количество клеток, поврежденных в той или иной степени, что проявляется в набухании и, соответственно, увеличении их объема. Поэтому суммарная степень повреждения эритроцитов, определенная согласно предлагаемому способу, несколько выше, чем определенная только по проценту их гемолиза.Изобретение позволяет снизить, погрешность определения и проводить определение в среде, содержащей антибиотики,Формула изобретения Способ определения степени повреждения эритроцитов, включающий оценку со1663549 дения эритроцитов рассчитывают по форму-:леП =Г+(100-Г) (1- - ),Йо стояния мембран в суспензии эритроцитовопытного и контрольного образцов, о т л и ча ю щ и й с я тем, что, с целью повышенияточности при одновременном расширенииобласти применения способа, определяют 5распределение по объему клеток в суспензии контрольного образца, затем проводятлизис эритроцитов контрольного образца иопределение в нем содержания гемоглобина, суспензию эритроцитов опытного образца центрифугируют, определяют содержаниегемоглобина в надосадочной жидкости, осадок эритроцитов опытного образца ресуспендируют в плазме крови, определяютколичество клеток, распределение которых по объему идентично распределениюв контрольном образце, а степень поврежгде П - степень повреждения эритроцитов, ОГ - степень гемолиза эритроцитов в опытной пробе по отношению к соответствующей контрольной пробе, ;Но - количество подсчитанных клеток в ресуспендированном осадке;й - количество клеток в ресуспендированюом осадке, распределение которых по объему идентично распределению по объему клеток в контрольном образце. Таблица 1 Сепень повреждения по выхо ионов К25, +0,2 14,7+0.8 31,2+3,8 Табл ица 2 Сепень повреждения по выходу ионов К-,ь11,2 -3 64,9+2,2 31,3+4,5 Таблица 3 Таблица 4 Степень повреждения по выхо гемоглобина,Степень повреждения по выходу гемоглобина, оСтепень повреждения согласно и е агаемом,Степень повреждения согласно предлагаемому способ,