Способ определения фракций казеина молока

СООЗ СОВЕТСНИХаыцнлешикРЕСПУБЛИК 6% (И) щ С 01 И 4 ИЕ ИЭ ТЕН ЛИС сится к аналитинной биохимии вванию казеннов мо - увеличение топособаяют следующим об бусос" соя, ванора,лита эл пользую ОСУДЮфСТВЕННЫЙ НОМИТЕНО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТПРИ ГКНТ СССР ОМУ СВИДЮЕЛЬСТВ(56) Авторское свидетельство СССРР 302663, кл. С 01 11 33/04, 1971.(54) СПОСОБ РПРРДЕЛЕПИ ФРАКЦИЙ КАЗЕИНА МОЛОКА(57) Изобретение относится к пищевойдромыипенности, а именно к аналитической и копичественной биохимии, вЧастности к исследованию казеина вщелоке. Цель изобретения - увеличениеочности и упрощение способа. Дня растворения казеина и электролита элек 1 уойоретической камеры используютЮарбиталовый буферный раствор с рНф,60-8,75, состоящий из 15,48 г бар 3 итала натрия, 2,75 г барбитала наМ,л дистиллированной воды и 8,0 М моИзобретение отн ческой и количеств частности к исслед лока.Цель изобретени ности и упрощениеСпособ осуществл разом. створения каэеина и электр трофоретической камеры исбарбиталовый буферный раст чевины, а для растворения геля агарагара используют смесь буферных растворов с рН 8,6-8,75, состоящую избарбиталового раствора, содержащего30,96 г барбитала натрия, 5,50 г барбитала на 1 л дистиллированной в:,дыи 34,52 г триса, 4,80 г цитрата на1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смесимочевины в количестве 8,0 М, Дляэлектрофореза используют агар-агар1,4-1,5 Х-ной концентрации, толщиной2,8-3,0 мм, размером 138 х 200 мм, приготовленного из 30,0 ью З -нага расплавленного при 70-80 С геля агарагара, барбнталового раствора в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той жетемпературой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при этом казеин используют 6,8-7,2 Е-ной концентрацич вколичестве 0,019 мл в барбиталовомбуферном растворе рН 8,60-8,75 и содержанием 8,0 М мочевины,.вор с рН 8,60-8,75, состоящий нз 15,48 г барбитала натрия, 2,75 г битала на 1 л дистиллированной в и 8,0 М мочевины, а для растворе геля агар-агара используют смесь ферных растворов с рН 8,60-8,75, тоящую из барбиталового раствора держащего 30,96 г барбитала натри 5,5 г барбитала на 1 л дистиллироной воды и трис-цитратного раств состоящего из 34,52 г триса, 3,816494274раствора, разогретого до 80 С. Послеохлаждения раствора до 1 С объемего доводят до 1 л барбиталовым буфет ром, Раствор казеина хранят в холодильнике при +20 С.Агар-агар марки Корсаковский в количестве 30,0 г/л промывают дистиллированной водой встряхиванием на шу.тель аппарате 3-4 дня. Воду меняют103 раза в сутки. Суспенэию агар-агарв2,5 ч расплавляют на кипящей водяной о бане. Добавляют 0,001 г/л мертиолята.Фильтруют через 10 слоев белой марли,разливают в стеклотару для одноразового использования. Закрытыми хранятвпрок при 6 С в холодильнике.Для растворения геля агар-агара используют смесь двух буферных растворов с рН 8,75, подогретую до 80 С,состоящую из барбиталового раствора,содержащего 30,96 г барбиталового натрия, 5,5 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 34,52 г триса, 4,8 гцитрата на 1 л дистиллированной водыв соотношении 1:1 с последующим добавлением к полученной смеси мочевиныв количестве 8,0 М. цитрата на 1 л дистиллированной водьс последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 МПри этом для электрофореэа используюагар-агар 1,4-1,5 -ной концентрации,толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138 ХК 200 мм, приготовленного из 30 мл3%-ного расплавленного до 70-80 С геоля агар-агара, барбиталового раствори трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и29,4 г мочевины, которые смешивают добразования однородной жидкости, аказеин используют 6,8-7,2%-ной концентрации в количестве 0,019 мл. Количественное определение Фракций казеина проводят на микрофотометре сВавтоматической записью денситограм.Барбиталовый буферный раствор вкачестве электролита выгодно отличается своей стабильностью, посколькуодин и тот же объем его можно использовать для 10-12 электрофоретическихраэгонок,Для проведения одного анализа используется только 30 мп образца молока,Применение геля агар-агара 1,41,5%-ной концентрации в растворедвух буферов барбиталового и трис 30цитратного, 8,0 М мочевины в сочетании с использованием малого объема(0,019 мл) 6,8-7,2%-ной концентрацииказеина в барбиталовом буферном растворе и 8,0 И мочевины способствуют 35глубокому расщеплению дисульфидныхсвязей в структуре каэеина и четкомуего делению на 16-18 отдельных фракций.П р и м е р. Общий казеин получают 40из 30 мп свежего обезжиренного коровьего молока путем прибавления к немусмеси (1:1) 0,1 н, уксусной и солянойкислот при рН 4,6. Каэеин получаютцентрифугированием. Осадок казеинарастворяют в 30 мл дистиллированнойводы, центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Свободный от сывороточных белков казеин переосаждают2 раза в 0,1 М растворе МаОН и 0,1 н. 50растворе смеси 1:1 уксусной и соляной кислот. Затем казеин растворяют,в барбиталовом буферном растворе срй 8,6, состоящем иэ 15,48 г барби"тала натрия, 2,75 г барбитала на 1 лдистиллированной воды и 8,0 М мочевины, Дпя этого 480 г мочевины растворяют в 490 мл барбиталового буферного Затеи проводят электрофорез с использованием казеина 6,8-7,2 -ной концентрации в количестве 0,019 мл, агарагара с размером 138 к 200 мм, приготовленного из 30 мл, З -ного расплавленного геля агар-агара при 80 С, барбиталового раствора в количестве8,0 мл и трис-цитратного раствора вколичестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, наносят на фиксированную рамкой (138 к 200 кЗ мм) химически чистуюстеклянную пластину (230 к 160"2 мм) настолике. Последний, помещенный в бытовой холодильник с температурой 6 С,предварительно нивелируют по горизонту. Лля лучшего сцепления блока агарагара со стеклом последнее покрываюттонким слоем 3,0%-ного расплавленногогеля агар-агара и прогревают при 80 С.Во избежание вытекания жидкого геляиз рамки ее заплавляют с внутреннейстороны раэогретьм 3%-ным гелем агарагара при помощи пастеровской пипетки. Пластину с гелем оставляют в холодильнике на ночь до следующего утра. Во избежание возможного эамерзания и испарения геля его сверху эакрывают и утепляют,15 Формула 5 16Прозрачный твердый блок геля агарагара освобождают от рамки, ставят на трафарете, вырезают 8 лунок размером 10 Х 1,5 мм на расстоянии 6 мм одну от другой и 90 мм от катода ( - ) . В каждую лунку микропипеткой вносят по 0,019 мл раствора 6,8-7,27-ного казеина. Блок геля с материалом кладут на металлический столик с охлаждением проточной водой электрофоретической камеры.Две кюветы электрофоретической камеры заполняют по 1 л барбиталовым буферным раствором с рН 8,75, состоящим из 15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины. Для этого 480,0 г мочевины растворяют в 490 мл барбиталового буферного раствора, разогретого до 80 С. После охлаждения раствора до 17 С объем егоодоводят до 1 л барбиталовым буферным раствором, Контакт между блоком геля агар-агара и буфером кювет электрофоретической камеры с платиновыми электродами осуществляют при помощи порблоновых мостиков-фитилей размером 150 ябЗФЗ мм. Электрофорез проводят при следующем режиме: 80 В - 60 мин, 130 В - 75 мин и 180 В - 180 мин.После окончания электрофореза стеклянную пластину с.гелем 36 ч фиксируют в 1 л 47,-ного раствора уксусной кислоты, сменяя его 2 раза. Отмытый гель сверху закрывают промоченной фильтровальной бумагой размером, соответствующим блоку, во избежание обо разования трещин, сушат при 37 С, красят 1 ч 17-ным раствором амидочерного 10 В на 7,ОХ-ной уксусной кислоте. Затем отбеливают протеинограммы 2, ОЕ-ным раствором уксусной кислоты с добавлением 27;ного глицерина. Количественное содержание каждой из 16-18 фракций казеина определяют сканированием (микрофотометр) с автоматическим самописцем и интегратором. Общий казеин согласно предложенному способу разделяется на 16- 18 четких фракций, которые соответствуют 6-9 фракциям Ф-казеннов, 2-3 фракциям К-казеннов, 3 фракциям (3-казеннов и 5-7 фракциям-казеинов.Использование предлагаемого способа определения фракций казеина моло 494276ка обеспечивает увеличение точностиделения казеина на фракции и упроще-ние его выполнения, увеличение числа 5четких фракций казенка молока до 1618, сокращение времени процесса электрофореза с 18,5 ч по прототипу до5,25 ч, т.е. в 3,5 раза.Количественное определение содержания фракций казеина на микрофотометре с автоматической записью денситограмм является объективным способом исследований, устраняет элементручной обработки электрофореграмм. и зобр ет ения Способ определения фракций казеинамолока, предусматривающий растворение 20 казеина, геля агар-агара, электролитаэлектрофоретической камеры в буферномрастворе, проведение электрофореза сиспользованием агар-агара и казеинаи определение фракций казеина, о т 25 л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения точности и упрощенияспособа, для растворения казеина иэлектролита электрофоретической камеры используют барбиталовый буферный 30 раствор рН 8,6-8,75, состоящий из15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной водыи 8, О И мочевины, а для растворениягеля агар-агара используют смесь буферных растворов с рН 8,6-8,75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия и5,5 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и трис-цитратного раствора, 4 состоящего из 34,52 г триса, 48 гцитрата на 1 л дистиллированной водыс последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 К,а для электрофореза используют агар агар 1,4-1,5 Е-ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138 х 200 мм,приготовленного из 30 мп З -ного расплавленного геля агар-агара при темопературе 70-80 С, барбиталового раст вора.в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 млс той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при этомказеин используют 6,8- 7,27-ной концентрации в количестве 0,019 мм.