Способ получения иммуностимулятора

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК КОМИТЕТОТКРЫТИЯМ ОСУДАРСТВЕННЬО ИЗОБРЕТЕНИЯРИ ГКНТ СССР ИЗОБРЕТЕН ПИС ИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСКОЮ но-исследователбиопрепаратовА. ПрокопьевСамарцев р. Состав и би та из клеточнь аг 1 сцз 1 В. с. 101 - 109. ство СССР 5/74, 1987. ологих сте - БиоИзобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий.Целью изобретения является повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия.Пример 1. Получение модифицированного иммуностимулятора.В качестве исходного сополимера используют совиаль - сополимер винилпирролидона с диэтилацеталем акролеина, который превращают в сополимер со свободными альдегидными группами следующим образом. Раствор 1,8 г совиаля в 80 мл 0,01 М соляной кислоты в течение 2 ч нагревают на кипящей водяной бане. Полученный раствор охлаждают и нейтрализуют 4 М едким(71) Всесоюзный научинститут особо чистых(56) О. В. Галкина и дческое действие препаранок 1 ас 1 оЬас 11 цз Ьцдтехнология, 1986,1,Авторское свидетель143978, кл. А 61 К 3(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА(57) Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий. Цель изобретения - повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия. Для этого выделяют пептидгликан 1 ас 1 оЬас 11 цз Ьцдапсцз, подвергают его ультрафильтрации на мембранах с минимально удерживаемой мол. м. 5000 в 100 и отработке водным раствором сополимера М-винилпирролидона с акролеином при массовом соотношении пептидгликан - полимер 1:(1 - 3) с последующим сублимированием. натром до рН 7,5 - 8,5, после чего к нему добавляют 0,1 М боратный буфер с рН 8,5 - 9,5 до объема 180 мл. К 7 мл полученного раствора (что соответствует 70 мл исходного сополимера) добавляют 40 мг лиофильно высушенного препарата пептидгликана. Раствор выдерживают в течение 2 - 4 ч при комнатной температуре, после чего добавляют 1 О мг боргидрида натрия и через 1 час концентрируют раствор до объема 3 мм, промывают двукратно 10 мл воды. Раствор лиофильно высушивают и определяют содержание пептидгликана в сухом препарате по аминокислотному анализу.Примеры 2 - 4. Следующие образцы модифицированного иммуностимулятора получают аналогично примеру 1 при измененных соотношениях исходных реагентов и различных способах нейтрализации альдегидных групп, как это показано в табл. 1.1630830 формула изобретения Таблица 1 Количество ис- Количество Нейтрализацияальдегидныхгрупп 11 ример ходного совиаля, мг исходногопептидгликана, мг Реагент Количество,мг 70 70 Этанол аминБоргидриднатриятрет;Бутиламин 300 800 80 150 Пример 5. Получение модифицированного стимулятора с пониженным содержанием белка.Препарат пептидгликана растворяют в воде до концентрации 2,3 мг/мл (оптическая плотность при 280 нм 1,2) и фильтруют раствор через мембрану РМ-О с минимально удерживаемой мол. мас. 10000. Оптическая плотность фильтрата, содержащего пептидгликан, 0,05, т. е. практически весь белок остается в концентрате над мембраной.К 20 мл полученного фильтрата добавляют 30 мл раствора гидролизованного сополимера (концентрация 3 мг/мл) и выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют 20 мг солянокислого гидроксиламина и через 1 ч концентрируют раствор с использованием мембраны РМ, концентрат подвергают лиофилизации.При,чер б. Определение иммуностимулирующей активности образцов.Определение проводят на мышах-гибридах Г (СВАхС 57/В 1.). Образцы препаратов вводят однократно внутривенно в дозах 5,0 и 0,5 мг на 1 кг веса животного в 0,5 мл стерильного физраствора. Животным контрольных групп вводят эквивалентное количество растворителя. Число антителообразующих клеток селезенки (АОК) оценивают методом локального гемолиза на пятые сутки после иммунизации мышей эритроцитаМи барана в дозе 10 клеток на мышь. Достоверность различий оценивают по критерию 1 Фишера( 1 ыодента.Результаты исследования приведены в гибл. 2.Из данных, представленных в табл. 2, видно, что при использовании иммуностимулятора, полученного по предлагаемому способу, для достижения эффекта, получаемого при использовании известного способа, требуются меньшие дозы (в 10 раз).Пример 7. Оценка иммуностимулирующей активности по индукции интерлейкина. Адъювантное действие известных иммуностимуляторов связано с их способностью вызывать индукцию образования интерлейкинаклетками моноцитарного ряда и ин.терлейкина(ИЛ) Т-клетками. Поэтому в качестве тест-системы для сравнительного изучения иммуностимулирующей активности препарата, полученного по предлагаемому способу, используют также анализ уровней ИЛпосле введения препарата животным.Препараты вводят животным внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг. Через 1, 3, 5 и 10 сут клетки селезенок мышей эксплантируют ин витро и исследуют продукцию ИЛв ответ на конканавалин А (КонА) (1 мкг/мл).15 Результаты исследований приведены втабл. 3.Из данных, приведенных в табл. 3, видно,что введение препарата вызывает гиперпродукци 1 о ИЛселезеночными клетками мыши. При этом ИЛ- индуцирующее действие пептидгликана по известному способу проявляется через 5 сут, но практически прекращается через 10 сут, в то время как введение препарата, полученного по предлагаемому способу, приводит к сохранению 25 эффекта в течение 10 сут, т. е. к пролонгированному действию. Способ получения иммуностимулятора, З 0 включающий выделение пептидгликана 1.ас 1 оЬасцз Ьцдаг 1 сцз 1.Вс последующим сублимированием, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и увеличения продолжительности действия, перед сублимированием пептидгликан подЗ 5 вергают ультрафильтрации на мембранахс минимально удерживаемой мол. м. 5000 - 10000 д и обработке водным раствором сополимера Х-винилпирролидона с акролеином при массовом ссютношении пептидгликан - полимер 1:1 - 3.1630830 Таблица 2 Препарат Стимуляция, 7 Количества АОК на 10 в Доза, мг/кг клетокселезенки Контроль (Физраствор)Пептидгликан по известному способу 152+7 и и и Таблица 3 Включение Н-тимидина клетками СТЬ 1.срм) 3 11 репарат дляинъекции Г 1 1 Р 10 сут Р 5 сут 7670+1050 210590 0,01 8100+1240 0,01 13200+1330 9800+1 В 16011090+1780 0,01 Составитель С. ПыловаРедактор Л. Веселовская ТехредА.Кравчук Корректор С. ШевкупЗаказ 5 Тираж 449 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Производственно. издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул. Гагарина, О По примеру 1То жеКонтроль (физраствор)По примеру 2По примеру 3По примеру 4 Контроль