Штамм асinетовастеr р. -продуцент гидролазы n-карбамоил-5 фенилглицина

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) БРЕТЕНИЯ ЛЬСТВУ объедиствен Маслинск Тз 1 оп огго Р-аш 11 ТесЬпо зсег. опте сиз гоЬ 1 СТУК-ЯР-ПРОПУПРНТ Л-фЕНИЛГЛИПИНА осится к микрог етение ой про относится к микробионпленности, в частнового штамма - олазы И-карбамоил- оторый может быть исолучения 0-ФенилглиИзоблогичесности кпродуцеФенилглипользовцинн. получениюта гидрпина, кн для и ль изобретения - получение штамболее высокой активностью гидро- Е-карбамоил-Б-Фенилглицина.амм АсдпегоЬасгег зр, ВКПМ 8 (М 4) выделен из почвы. Выпелеарбамоилазного продуцента провов 3 этапа.Селекция микроорганизмор.обы ич природных источников кульовали при 30 С три недели в каных колбах с селективной средой севы делали через неделю) следуо состава, г/л: 0-карбамоилФенилн 1; МВВО 7 НО 0,2; КНРО1 с азы е ал ер глици ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ А ВТОРСКОМУ(57) Изобретение отн 1)5 С 12 И 9/16, 1/20 биологической промьпппенности, в частности к получению штамма - продуцента гидролазы М-карбамоил-Фенилглицина, который может быть испольчовандля получения П-Фенилглицина, необходимого для производства синтетического антибиотика ампицилина. Пельизобретения - получение штамма, обладающего более высокой активностью.гидролазы И-карбамоил-Фенилглицина. 11 тамм Ас 1 пегоЬасйег зр. ВКПМВвыделен из почвы, Штамм синтезирует Фермент с активностью49,8 ф 0,7 мкмоль мин- г - при 40 С,концентрации субстрата 5 мкл в 0,1 МФосФатном буФере, рН 725. 1 табл. Мп С 14 Н О 0,01; СаС 12 Н 0 0,02; рН 7,0, Полученную смесь, богатую микроорганизмами, способными усваиват Р-карбамоилйенилглицнн, высевали в чашки Петри с агаризованной средой такого же состава. При пересевах отдельных колоний получили 43 чистые микробные культуры, которые использовали для определения карбамоилазы./ 2, Качественное определение карбамоилачы хроматограФическим способом,Чистые культуры культивируют в качалочных колбах с жидкой питатель ) ной средой следующего состава, г/л; мясной экстракт 1; дрожжевой экстракт 2; пептон 5; ИаС 1 5; П-карбамоилФенилглицин 1. После суточной инкубаци)ь при 30 ОС биомассу центриФугируют, лиоФилизуют. 20 мг сухих клеток инкубируют с 1,5 мл 0,5 Х-ного1599433 П-карбамоилАенилглицина в 0,1 М АосАатном буАере (рН 8,0),при 40 С втечение 60 мин на магнитной мешалке,В начале и в конце реакции берутпробы по 5 мкл и наносят на хроматограАическую пластинку с силикагелем.В качестве контрольного раствора берут 5 мкл О, 1 Х-ного Аенилглицинав 0,1 М АосАатном буАере ХроматограАическую пластинку высушивают ипогружают в чоситель (1:4 = ИНОН;фЕг ОН). Проявляют опрыскиванием0,57,-ным спиртовым раствором нингидрина, Образование Аенилглицина обнаружено у 18 бактериальных культур,3. Количественное определение карбамоилазы,Определение проводят по методике,отработанной в лаборатории техноло- щ 0гии биокаталитических процессов НПО"Фермент".СпектроАотометрически карбамоилазную активность показали 8,культур . Наиболее активный штамм1АсжегоЬасйег зр, М 4 имеет показатели активности 49,8 ф 0,7 мкмоль/мин г,Морфологические признаки: палочковидные клетки размером 1,0-1,5 мкм.одиночные или парами, неподвижные,грамотрицательные, спор не образует.Физиологические признаки: колониина МПА после суточной инкубиции при37 С рН 7,0 непигментированные, блестящие, выпуклые, край ровный, размер 1-2 мм при 25 и 45 ф С рост слаУ35бый; сахаров до кислыми продуктов неметаболизирует, желатину не разжижает, крахмал не гидролизует, молоконе свертывает, на картошке не растет,нитратов не усВаиВаетиз источникОВ 40азота лучше всего использует пептон,гидролизат дрожжей, Культура хранится в лиоАилизированном состоянии вампулах,П р и м е р, Биомассу штамма АспеоЬасгег зр. М 4 получают при вы 111 тамм АС 1 пегоЬасгег зр,ВКГУ В-продуцент гидролазы М-карбамоил-Аенилглицина,А - П ( + з)( +Лй. ш Ячт где дй - разница отческой плотности во время реакции 3 г (в данном случае 10 мин),"щ - количество клеток, г;Е - молярный коэААициент экстинкции продукта реакции с4,6-тринитробензолсульАокислотой, Е= 9400 м см -;ч - объем инкубируемого раствора, мл; разливании в качалочных колбах объемом 750 мл (количество среды 100 мл)при 37 Г с 240 об./мин, Используютпитательную среду следуюшего состава, г/л: мясной экстракт 1; гидролизат дрожжей 2," пептон 5; натрий хлористый 5; И-карбамоилАенилглицин 1;РН 7,0, После стерилизации при 120"С30 мин петлей засевают суточную культуру, Колбы инкубируют на качалках20 ч. Биомассу отделяют центриАугироанием при 10 000 Об./мин, промывают 0,87,-ным раствором хлористого натрия и лиоАильно высушивают,Карбамоилазную активность измеряют по начальной скорости образования Аенилглицина, определяемого по цветной реакции с 2,4,б-тринитробензолсульАокислотой. Для этого проводят Аерментативный гидролиз при 40 С в термостативных кюветах при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Берут 20 мг (ш) сухих клеток, добавляют 1,5 мл (у,) 0,57-ного П-карбамоилАенилглицина, растворенного в 0,1 М АосАатном буАере (РН 7,25), Из перемешиваемой магнитной мешалкой смеси после 5 и 15 мин от начала реакции отбирают пробы объемом по 0,01 мл (тт ) и вливают в пробирки с 2,5 мл (у ) боратно-АосАатного буАера (7,6 г 11 аЯ О 1 ОН О/1 л Н О + КН РО концентрированный раствор до РН 8,5). Смесь центриАугируют 10 мин при 10 000 об,/мин, Осторожно берут 2 мл ( ) надосадочной жидкости и добавляют 0,1 мл (ч ) раствора 0,77-ной 2,4,б-тринитробензолсульйокислоты. Инкубируют 30 мин при 40 С, Разницу оптической плотности 9 й) между пробами определяюг при 420 нм спектроАОтометрически,Карбамоилазную активность вычисляют по Аормуле 17.) 1 10МКМОЛЬ/МИН Г В таблице приведены данные о карбамоилазной активности штамма Ас- пегоЬасгег зр. М 4 и прототипа - АргоЬасгегшш гадхоЬасгег,Формула изобретения6 Карбамоилазная активность, мкмоль минг Пр одуцен т АсхпейоЬасйег ер. М 4АягоЬасегца гаИоЪасйетф данных но образованию Э-фенилглицина. Составитель Е. Воробьева Техред М,Мор-.ентал Корректор Н, Король Редактор Л, Веселовская Заказ 3123 Тираж 484 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, 3-35, Рауш"кая ньб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101Приведено стандартное отклонение 3Значение вычислено из кинетических 49,8+0,У 12,3 т опытов (в колбах),