Способ получения биомассы возбудителя малярии рlаsмоdiuм fаlсiраruм

(19) (11) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ясен Дж. Бюлл78, Р 2-3,БУ Ы, ВОСТРАКбиолитоловыхо гии ии. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМА(57) Изобретение относитсяи медицине, а именно к параЦель изобретения - повышени Изобретение относится к биалогиии медицине, а именно к паразитологии.Цель изобретения - повышение выхода биомассы возбудителя малярии Р. Ка 1 срагош,Изобретение основано на методе частых пересевов со свежими отмытьии эритроцитами.Используют 50 -ную суспензию эритроцитов человека. 5 - 10 мл крови человека переНосят в, стерильные центрифужные пробирки и центриФУГируют рри 2000 об/мин в течение 5 - 10 мин. -Плазму и лейкоцитарный слой удаляют пипеткой, а осажденные клетки ресуспендируют в равном объеме ВРИ 1-1640 - без сыворотки с исходным рН 7,2. - 73. Затем еще дважды центриугируют и удаляют надосадочную жидкость. Клетки суспеидируют в равном объеме Ц 1)Ю А 61 К 39/02, С 12 И 5/00 2биомассы возбудителя малярии Р 1 азпюй 1- цш Га 1 срагпш. При пропускании суспензии эритроцитов через колонку-капилляр лизируются те клетки, которые являются непригодными для культивирования паразитов. Отличительным признаком способа является снижение гематокрита клеточной суспензии с 10 (до пропускания) до 6 - 8 Х (после пропускания). Оптимальное число пропусканий через колонку 20 - 25 раз, При соблюдении этих условий и последующем пересеве со свежими эритроцитами наблюдаются значительная стимуляция роста паразитов в культуре и увеличение выхода биомассы возбудителя маля- а рии. 1 табл.Ж ВГИ 1-1640 с 10 Х-ной сывороткой соответствующей группы, Таким образом, получают 507.-кую суспензию эритроцитов. Культуральные клетки переносят в центрифужную пробирку и центриФугируют в течение 3-4 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают, к осажденным эритроцитам добавляют равный объем полной питательной среды и получают 50 Ж-ную суспенэию клеток. После тщательного переменивания в стерильных условиях к суспензии эритроцитов из культуры добавляют 503-ную суспензию свежих отиытых эритроцитов, чтобы конечная паразитемия была 0;3 - 0,5 Х, Затем, чтобыполучить 103-ную клеточную суспензию, прибавляют полную питательную среду ВРМ 1-1640, НЕРЕЯ (25 ммоль/л) + 103 сыворотки + 5 Х МаСОз, рН 7,2, 1563700Суспензию тщательно перемешивают пастеровской пипеткой, разливают в куль-.,туральные чашки по 1,5 мл в каждую ипродолжают культивирование. Оценкурезультатов производят в тонких мазках, подсчитывают паразитов на 1000эритроцитов и выражают в процентах.При культивировании молярнйных паразитов при высокой паразитемии, отсУтст Овии смены среды и т,д, происходитухудшение состояния культуры: задержка роста и размножения паразитов.Для коррекции этих неблагоприятныхизменений обычно. используют способчастых пересевов, однако положительный эффект, т,е. стимуляция роста паразитов, наблюдается примерно в 50%случаев (в зависимости от исходного,состояния паразитов). Присутствиехрупких эритроцитов, находящихся впредгемолитическом состоянии и непригодных для развития в них паразитов, препятствует эффективному культивированию. 25Согласно предлагаемому способуэритроциты пропускают через колонкукапилляр с последующим замещением ,разрушенных клеток свежими эритроцитами, Используют культуру, в которойнаблюдается замедленное развитие па-,разитов и встречаются патологическиеформы возбудителя,Клетки переносят в центрифужнуюпробирку и затем пропускают черезстеклянную колонку-капилляр длиной300-350 мкм, имеющую 6 - 8 суженийкапиллярного диаметра 80 - 100 мкм.Отверстия меньшего диаметра не пропускают суспензию, отверстия большего 40диаметра пропускают клетки свободно,не вызывая лизиса, Толщина колонки5 - 8 мм определяется требованиямитехнической прочности изделия.Число пропусканий, необходимоедля удаления хрупких эритроцитов изкультуры, подбирают для конкретныхусловий. При этом исходят чз показателей гематркрита суспензии до и пос"ле пропускания. Гематокрит - отноше-;.ние объема (упакованных) интактныкэритроцитов к объему всей суспензии -определяют центрифугированием в узкомкапилляре.Снижение величины гематокрита помере пропускания клеток через колонку указывает на лнзис эритроцитов.Для стандартных условий культивирования (гематокрит суспензии в культуре. составляет 10%) используют 20 - 25- кратное пропускание клеток через колонку с шестью капиллярными сужениямиеП р им е рИз четырех культуральных чашек сливают содержимое в стерильную пробирку и перемешивают, Определяют гематокрит полученной суспензии. Колонку предварительно стерилизуют, промывают средой и высушивают. С помощью большого шприца создают отрицательное давление и пропускают суспензию через колонку. Пропускание повторяют 10 раз, после чего определяют гематокрит конечной суспензии, Если он снижается до 6 - 8%, то обработку останавливают. В противном случае пропускают еще 5 раз и снова измеряют гематокрит, т.е. устанавливают зависимость конечного гематокрита от числа пропусканий . В дальнейшей работе пропускают суспензию фиксированное число раз без определения гематокрита.Пропускают через колонку 15 раз (А) суспензию с гематокритом 10% гематокрит конечной суспензии не изменяется и составляет 10% (см. таблицу). При пересеве этих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают паразитемию. Заметного размножения паразитов через 48 ч не происходит. Пропускают суспензию через колонку 20 раз - конечный гематокрит снижается до 8%. При пересеве этих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают паразитемию. Рост паразитемии увеличивается в 6,6 раза (Б). Пропускают суспензию через колонку 25 раз, Рост паразитемии увеличивается в 4 раза. Конечный гематокрит снижается до .6% (В).Пропускают суспензию через колонку 30 раз, происходит лизис зараженных эриФроцитов (Г).Таким образом, эффект последующейстимуляции размножения возбудителя вкультуре достигается при 20 - 25-:кратных пропусканиях через колонку,при этом гематокрит суспензии снижается на 2 - 4%. Дальнейшее снижениегематокрита нецелесообразно, так какостается слишком мало клеток для пересева и, кроме того, начинают разрушаться эритроциты, содержащие возбудителей,1563700 Число паразитов/1000 эритроцитов Гематокрит, Х Число Про- цесс пропусканий после обработки через 48 чи пересева до пропус- после прокания пускания8 12 9 58 7 43 Лизис зараженных эритроцитов 10 10 10 1 О А Б В Г 15 20 25 30 10 8 6 4Составитель С. ПыловаРедактор М. Петрова Техред Л.ОлийныкКорректор Т. Палий Заказ 1115 Тираж 546 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10 После обработки суспензию центрифугируют, удаляют надосадок, К осадку приливают 5-кратный объем полнойпитательной среды. Затем центриФугируют, отбирают надосадочную жидкость. -К осадку добавляют 5-кратный объемполной питательной среды и центриФУгируют в течение 3 мин со скоростью1000 об/мин, Отмывание повторяют доудаления следов гемолиза.После удаления надосадочной жидкости в пробирке остается 0,3 мл клеток . Далее, чтобы получить 50 Е-нуюсуспензию, к осадку добавляют равныйобъем полной питательной среды. Тщательно перемешивают и готовят мазок,красят по Романовскому-Гимза и подсчитывают наразитемию,Выход биомассы (т,е. количествопаразитов на 1000 эритроцитов) значительно выше (н 4-5 раз) при включегппг предлагаемого способа в процессе культивирования,5 Формула изобретения Способ получения биомассы возбудителя малярии Р 1 азшойшп Га 1 срагиш, 10 включающий получение суспензии -зараженных эритроцитов, культивированиевозбудителя в питательной среде путемпересевов с добавлением свежих эритроцитов, о т л и ч а ю щ и й с я 5 тем, что, с целью повышения выходабиомассы возбудителя, перед пересевомсуспензию эритроцитов продавливаютчерез колонку с микрокапиллярными суспензиями, пропускающими эритроцитыдо получения 6-87. суспензии эритроцитов.