Штамм бактерий rнizовiuм тrifоlii, используемый для получения нитрагина под луговой клевер

)5 С 05 Г 11 2 И 1/2 ОПИСАН Н АВТОРСКОМ РЕТЕНИЯ СВИДЕТЕЛЬСТВ К ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР(56) Авторское свидетельство СССРР 1039934, кл . С 05 Г 1 1/08, 1983 .(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВН 1 ЕОВ 1 ЦМ ТВ 1 РОЫ 1, ИСПОЛЬЗУЕЖЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИТРАГИНА ПОД ЛУГОВОЙ КЛЕВЕР(57) Изобретение относится к сельск зяиственнои микробиологии и предИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый эффективныйштамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагинапод луговой клевер,Цель изобретения - создание нового штамма клубеньковых бактерий,обладающего повышенной эффективностьюв симбиозе с луговым клевером,Штамм ВЬгоЬыш гИо 1 д Р 99 депонирован в коллекции Всесоюзногонаучно-исследовательского институтасельскохозяйственной микробиологиипод Р 1360 и характеризуется следующими признакамиМорфолого-культуральные признакиф.в молодом возрасте бактерии палочковидные, размер клеток на гороховомагаре после 48 ч инкубации 0,8 хх 2,2 мк. Хорошо окрашивается в красставляет собой новьп эффективньп штамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагина по луговой клевер. Целью изобретения является создание нового штамма клубеньковых бактерий, обладающего повышенной эффективностью в симбиозе с луговым клевером, Штамм КЬгоЬиш Сг 1 йо 11 выделен из клубеньков лугового клевера и депонирован в коллекции ВНИИСХ Р 1360. Штамм позволяет увеличить урожай лугового клевера на 2,6 ц/га абсолютно сухой массы клевера по сравнению с известным штаммом. 2 табл. ный цвет раствором ЗОБ-ного эритрозина и 5 Е-ного фенола.Физиолого-биохимические свойства: органические среды. На гороховой среде (рН 7,0-7,2) колонии гладкие (форма Б), круглые с ровными краями. Диаметр колоний семисуточной культурыО при температуре выращивания 25 С 17 мм. Активность фермента каталазы на 1 г биомассы 11,2 - 11,5 мг НО за 30 мин. На среде МПА или ПА рост полностью отсутствует.Синтетическая среда Норриса с дрожжевым экстрактом, Колонии глад ие (форма Б), с ровными краями, Диаметр пятисуточной культуры 16-18 мм.Отношение к источнику углерода. Усваивают глюкозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, маннит с небольшим подкислением среды. Лучше всего усваивает сахарозу наагаризованных средах, давая болееплотную биомассу,Отношение к источникам азота. Использует азот ИННОэ(НН) БОКБО и карбамида СО(ИН) .Молоко пептонизирует с образованием прозрачного "кольца" на поверхности среды, которую подщслачиваютдо рН 7,8,10Крахмал и клетчатку не гидролизует,Нитраты восстанавливает.Температурный оптимум роста 27,5 С,Оптимальная реакция среды рН 6,5.На синтетической среде Норриса наблюдается рост при рН 4,4-10,0.Штамм Р 99 хранится на косом бобовом агаре в биологических пробиркахпри температуре 5 С, Ежегодно проводятся два пересева на бобовом агареи мясо-пептонном агаре (МПА) для ус-.тановления чистоты культуры,Эффективность нового штамма Р 99по сравнению с известными штаммами348 а и 329 б клубеньковых бактерийклевера изучали продолжительное время вегетационными (1976-1980 гг).,иполевыми (1980-1987 гг) опытами вусловиях дерново-подзолистых глеевыхлегких суглинков (рН 5,2-6,0) . Воз 1делывали луговой клевер сорта Лепсна", норма высева семян - 16 кг/гаиз расчета 100% хозяйственной годнос,ти, Подопытные почвы удобряли фосфорно-калийными удобрениями по60 кг/га Рй .и К О.В условиях вегетационных опытовштамм Р 99 при инокуляции повысилурожай абсолютно сухой массы клеверана 25% по сравнению спроизводствен 40нымиштаммами. Аналогичные. результатыполучены и в полевых опытах, где новый штамм дал прибавку урожая абсолютно сухой массы на 6,8 ц/га, с тем45как производственные штаммы даютот 3,1 до 5,4 ц/га (табл,1) .Инокуляция не имела существенногозначення на процентное содержаниесырого белка в урожае. Тем не менее,при положительном действии инокуляции нового штамма на урожай общийсбор сырого белка при этом значительно превышал уровень контрольныхи инокулированных производственнымиштаммами растений: прибавка сырогобелка составила 1,5 ц/га по сравнениюс неинокулированными растениями. Вто же время производственные штаммы способствовали прибавке белка в среднем на 0,4 ц/га.Следует отметить, что штамм Р 99образовывал на корнях несколько меньшеклубеньков (227 единиц на одном рас:стоянии), чем более вирулентный производственныйштамм 348 а, но превысилдругой производственный штамм 329 б.П р и м е р 1. Жидкую культуруклубеньковых бактерий выращивают впитательной среде следующего состава,%: кукурузный экстракт 1,0; (ИН) 040,05; сахар 1,0; КНР 04. ЗНО 0,05;М 8804 7 Н О 0,02; ХаС 1 0,02; мел 0,1.Стерилизация - 1,0 атм, 30 мин,рН.после стерилизации 7,0.Культуру разводят охлажденной стерильной водой и смешивают с нейтрализованным нестерильным торфом из расчета 1,0 г препарата - 0,7- - 1,0 млрц.клеток бактерий при влажности 50%.Для улучшения условий роста и выживаемости клубеньковых бактерий вторА вносят мелассу в количестве 6%от веса сухого торАа. Препарат помещают в специальные кюветы по 10-15 кгили в пакеты по 1,0 кг и выдерживаютв течение 5 сут при 20 С. Затем преопарат перемещают и расфасовывают по200-1000 г в пакетах полиэтиленовойпленки толщиною 40-80 мк, которыезапаивают и хранят при 5 С,ьВ течение 12 мес титр клеток клубеньковых бактерий составил 2,5 млрд/гпрепарата. П р и м е р 2. Инокуляцию стерильного торАа проводят иньекцией культу- ральной жидкости непосредственно в пакет, Торф влажностью 30% с добавкой мела расфасовывают в пакеты по О, 16; 0,33 и 0,80 кг (из расчета получения 1,2 и 5 га/порций препарата) при коэффициенте заполнения 0,5-0,7. Пакеты запаивают; упаковывают в картонные коробки и стерилизуют гамма- лучами (2,5 Мрад), Стерильный торА инокулируют иньекцией жидкой культуВры непосредственно в пакет. Инокулюм вносят из расчета 1,2 млрд/г бактерий при 60% влажности препарата. Отверстие от укола заклеивают клейкой лентой, В качестве питательной добавки при производстве препарата вносят 6% мелассы от веса сухого торйа. При 12 мес хранения ризоторАина титр сохраняется в среднем 4,5 млрд клеток/г препарата..,сырой белокв урожае сырой белокв урожае урожайабсолютвес а солютно сухоймассы клеколичество клу- беньков но сухоймассы ц/га г/сосуд ра со на одном растении чистого клевера,,4 а 2 а б Урожай абсолютно сухой массы чистого клевера, ц/ Сырои б.елоурожае ариант 1 Е ц/г 66,9 69,9 73,7 73,7 2,2 17,31 17,11 17,93 17,93 11,6 12,0 12,8 13,2 0,3 При изучении эффективности штаммов клубеньковых бактерий используют торфяные препараты этих бактерий в виде ризоторфина; Проводят инокуля, цию семян лугового клевера с исходным титром 450 х 109 клеток на гектарное количество семян или 50 х 10 клеЪ ток на одно семя.В табл.2 показано влияние иноку ляции лугового клевера различными штаммами РЬыоЬцш йг 1 Ео 111 в полевых опытах. Контроль (безинокуляции)Производственный штамм 348 аПроизводственныйштамм 329 бПредлагаемыйштамм Контроль (без инокуляции)Производственный штамм 348 аПроизводственный штамм 332 бШтамм Р НСРт 6Как видно из табл.2, в этой.се" рии полевых опытов штамм Ртакже показал хорошие результаты, Ло эффективности он превысил штамм 332 б на 2,6 ц/га урожай абсолютно сухой массы или на 6,8 ц/га по сравнению с контролем. Формула изобретенияШтамм бактерий КпдгоЬшщ йг 1 Ео 111 ВНИИСХМ, используемый для получения нитрагина под клевер луговой.Таблица Полевые опыты 1980-1987 гг,