Способ определения миоглобина

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОПИСА К АВТОРСНО Е ИЗОБРЕТЕНИЯСВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Горьковский научно-исследовательский институт эпидемиологии имикробиологии, Научно-исследовательский институт медицинской радиологииАМН СССР и Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР(56) Авторское свидетельство СССРВ 943573, кл. А 61 К, 39/00, 1982,непубликуеиое(57) Изобретение касается биологии,исследования биологических веществ,а именно миоглобина, предназначенного для ранней диагностики ряда заболеваний и патологических состоянийсопровоздающихся гиперииоглобинемиейи миоглобинурией, Цель изобретенияповышение точности способа зв счетповышения чувствительности методаопределения миоглобина в реакциигемагглютинации. Для этого получаютспецифические иммуноглобулины класса(51 ) 5 С 01 Я 3/48 С.Антитела выделяют колоночной аффинной хроматографией на иммуносорбенте с имиобилизированным миоглобином. Им" пульсную сыворотку против миоглобина циркулируют через иммуносорбент со скоростью 5 мл/г 15-18 ч. После отмывки с иммуносорбента неспецифически связанных белков осуществляют элюцию антител 0,2 м глицин - НС 1 - буфером, рН 2,2. Фракции со специфическими антителами объединяют, подщелачивают до рН 8,0 и дналиэуют против 500-кратного объема 0,01 М карбонатного буфера, рН 9,6. Концентрацию специфических антител против миоглобина определяют иэ спектрофотометрических данных при 1280 нм, ис- . 9 пользуя коэффициент экстинкции 1,98 х 10 М си . Ставят реакцию гемагглютинацин: сенсибилизированные аммуноглобулинами формалинизированные эритроциты кур против миоглобина. Ре- Я акцию проводят с помощью хлорида хрома и танина. Оптимальными установле- вфла ны соотношения антител к эритроцитаи фЬ (16-3,2) 10 . Повышение коэффициента шва приводит к спонтанной агглютинации ф эритроцитов и снишению воспроизводимости метода приготовления препарата, а уменьшение - к падению чувствительности диагностикума.И обретение отностс я к области сслелонация биологических веществ, а именно мцоглобина, и может быть использовано в различных биохимических исследованиях, в частности для ранней диагностики ряда заболеваний и патологических состояний, сопровождакщхся гипермиоглобинемией и миогло-, бинурией. 10Целью изобретения является повышецие точности способа за счет ловыщения чувствительности метода определения мцоглобцна в реакции гемагглютина ци. 15Процесс выделеция и очистки миоглобица, получение гипериммунных сывороток против миоглобцна осуществля.т в соответствии с известными методами. 20Спецфические иммуноглобулины класса С получают из гипериммунных сывороток от многократного и длительноиммунизированных животных. Антителавыделяют колоночцой аффинной хромато. 25графией ца иммуносорбенте с иммобилизироваццым миоглобнном. Приготовлениеиммуносорбецта осуществляют известнымметодом с использованием ВгС 1 активированной сефарозы 4 В в качестве матри.10цы,Иммунную сыворотку против миоглобина циркулируют через иммуносорбентсо скоростью 5 мл/ч в течение 15-18 чпри комнатной температуре. Послеотмывки с иммуцосорбента неспецифических связанных белков осуществляютэлюцию антител 0,2 м глицин-НС 1-буфером, рН 2,2, Скорость пропусканиябуфера 5 мл/ч, ФРакции, содержащие 4 Оспецифические антитела, объединяют,подщелачивают до рН 8,0 и диализуютпротив 500-кратного объема О, 1 М карбонатного буфера, РН 9,6.Концентрацию специФических антител 45против миоглобица определяют из спектрофотометрическх данных при длине.волны 280 нм, используя молекулярный козфициет экстицкции 1,98 хх 10 М см . Выделенные антителахранят при -20 С,оФормалинизация куриных эритроцитов.Собирают кровь от 200-300 бройлеров во флаконы с раствором Олсверав соотношении 1;1. Флаконы помещают,55в холодльник ца 3-4 Лця. 11 лазму уда"ляют, эритроциты тлнают центрифуги овацпем триждь н 20-кратцом объеме физиоогческго растнора. Готовят150 -уквзвесь клеток в физиологическом растворе. К 50 -цой взвеси клеток прибавляют 5-кратный объел 1 юиоогического раствора, содержащего 4% формальдегида и 0,5. глюкозы, РН 7,0. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре смесь переносят в холодцльцик (42 С), вьдерживают в течение недели с ежедневнымресуспендировацием эритроцтов. Через неделю надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов взвешивают в физиологическом растворе, содержащем 4% формальдегида, РН 7,0, Хранятформалннизированные эритроциты в ниде 50 взвеси при 4".2 С.Отсутствие споцтанцой агглютицации эритроцитов устанавливают следующим образом.В несколько лунок полистироловой пластины вносят по 50 мкл физиологического раствора и по 25 мкл 2-ной взвеси формалинизированных эритроци"тов. Если через 20-30 мин эритроцитыосядут в виде четкой точки, то онимогут быть использованы для дальнейней работы. Сенсибилизация формализированных эритроцитов иммуноглобулинами класса против миоглобина.Сенсибилизацию формалинизированных куриных эритроцитов иммуноглобулинами против миоглобина проводят с помощью хлорида хрома и танина, В специальных экспериментах была подобрана оптимальная концентрация специфических иммуноглобулинов класса С на 1 эритроцитарцую клетку, обеспечивающая высокую чувствительностьдиагностического прел рата, Оптимальными установлены соотношения антител к эритроцитам (1,6-3,2) 10 . Повь- шение значений коэффициента прводило к спонтанной агглютинации эритроцитов и снижению воспроизводимости метода приготовления препарата, а уменьшение - к падению чувствительности диагцостикума,П р и м е р 1. Приготовление Лиагностикума прц введении в реакпцо- ную среду 1,6 10 молекул иммуоглобулинов класса С ца 1 эритроцтарук клетку,К 1 объему раствора антител пртив миоглобина в концентрации400 мкг/мл добавляют 8 объемов дистиллированной волы, 1 объем 50%-,о14 591 б таян ю клетку. ВИ,3,",1 Здкдз 4335 трдж 518 Поп с вз ге .фол цц Г яд ц цлх к уц цз 1 ц трццтов ц 1 ог , и 0,3 д-цог; рд-норд хлоридд хргма. Смесь цнкубцруют при постоянном цемепцди 15- 20 мин прц комцдтной температуре, .осле чего эритроцть трижды о лвдют центрифугцрованцем прц 100 об/ пн в течение 10 мц Осадок эритроциз он сусл цдируют н растворе эдщтсй сре ды, состоящей из 1, 2.1,т, б рцой кислоты, О, 57. буры 107 сдхлрозы, 17 бычьего гыворот, ного д ьбуина до 2, 57-ной коццен-рации и тзиру 1 ВП р и м е р 2. Приготвлеццс ди агностикума црц введенин редкццонную среду 3,2 1 О и цекул лмуноглобулинов клдг.сдцд 1 зрцтроц тарную клетку, 20К 1 объему рлстворд ,нтцгел гр - тив миоглобица ц коццентр;циц ВОО мк/л, добавляют 8 объемов дстл.ироваццой воды,об ьем 507,-ной взвеси формдлинизировднцых курццых эртроцитов 25 и 1 объем 0,37.-ного раствора хлорда хрома. Последчте операции проводят по примеру 1.Специфическую активность зрит 1 оцитарцого диагносткума определяют З 0 в реакции пассивной гамдгглютицдццц ,РПГА), В 1 б лу,ок пластиць с Ч-образнь.м профилем лунок вносят по .Омкл физиологического раствора. В первую лунку вносят 50 мкл раствора логлобина с концецт,;дцией 1 мкг/мл и проодят его последовательные двукратные разведения путам переноса 50 мкл из лунки в луцку. В две к цтрольцьеьлунки миоглогцн це ццосяг. Затем во все лунки дсбдвяяют по 25 мкл 17.-ной взвеси эрцтрццтов с ллобилзлрованными ца цих дцттелами к мцоглобицу, Плдгтццу встрцхцпдю и оставляют при колц;тцсй тецердтуре. врез 4 20-30 мцц процдят ует рг зультдтогВ котргяцлх луках эрцтропты должны рд с рдоля т ся е 1 ге ч .тк ттчки цд Лце уц;ц, что ,отел ствует об отсут г;идмоцроцг цй50 агглктидц ,т 1 тн. 1,тп е, Л - пцт , б- О аг/. 1 лтццдцця цдбюдле, сч в лергх 9 луцк, х пластины, что стветствует лцил 1 1 ьн й Блея вля еой к. цце нтрдцц логл 10 а, рдцой . мг/мл, Прц использовднии дидгн.тцкума, приготовлеццо "о прц соотношении Ат/Эритт,3О дгглютццация ндблдается в 1; .уцкдх, что соответствует минимальной выявляемой концентрации миоглобинд, равной 0,5 мг/мг.Предложенный дидгностикум обеспе" чнздет в 10 раз повншение чувствите;тьности определеня лцоглобинд, уменьшает в 8-9 раэ время выполнения анализа ц существенно облегчает ход выполнения анализа за счет сок; дцецця этапов определения йоглобина, что важнс дчя ос уществлелця -кспресс.-диагностки инфаркта миокарда у пациентов в условиях скорой помощи и в учреждениях практического здравоохранения.Использование предлагдемого диагцостикумд обеспечивает ттовлшенис чуВ" ствительцости андли.,а в 10 раэ по сравнению с базовым объектом, уменьшени в 8"9 раз времени ьптполц ния анализа ; существенно об;егчает ход вп полнения анализа, что вашо дзя ос уа ствления экспресс-диа гнос тики инфаркта миокарда и пациентов в условиях скорой помощи и в уредениях практ:ческого здравг охрлчения. Формула изобретенпя Способ огцеделецця ми ь лобина путем цспользоваця сея. б; ццэировднлтх формдлзровд,х .Гитроцитов в реакции гемагглютндц":, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности опрг еецця эа еет повьппения чувстяцта .:ости реакции гемагглютицациц, пг.зуют эритроциты кур, сесблцзц днцые иммуноглобулиндми прот;егзобна пр соотношении (1,б,2 1 О молекул дцтит л клд".са Ь нд я . пцтроци