Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-1 в сыворотке крови

ZIP архив

Текст

,О к ЕТЕНИ 6/Щя р ТВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ САНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР, Центральный институт усовершенствования врачей, 2-й Московский медицинский институт им. Н. И. Пирогова, Всесоюзный кардиологический научный центр АМН ГССР и Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ 11 ИЯ 1 ЗОФЕ 1. МЕНТА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫВ СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к иммунологии и медицинской бпохпмпп. Цель пзоб. рстсппясоздание пыеокоепсцифичноп и проетогс в техппческом исполнении способа определения пзофермспта лактатдсгидрогспазы (ЛДГ1 в сыворотке крови. Для этого используют гетсрологические антитела, полученные к соотнстствуощему изофермснту ЛДГ свиньи. Удаляют с помощью ангител к М-субъединицам 4 изоформы ЛДГ. содержащие М-субъсдиницы, и измеряют активность оставшегося в тсстируемой сыворотке изофермента ЛДГ - 1, который не содержит в своем составе М-субьединиц. Способ включает 4 стадии: определение общей ферментативной активности ЛДГ в тестируемой пробе; обработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с целью связывания 4 изоферментов: ЛДГ; ЛДГ; ЛДГи ЛДГ; удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными формами ЛДГ центрифугированием; определение остаточной фермснтативной активности ЛДГ, соответствующей активности изофермента ЛДГГ 1 олнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными элсктрофореза в агарозе образцов сыворотки, взятых до и после обработки ее стафилококковым иммуносорбентом.Изобретснис стноситс к илмунологии и медицинской биохимииЦельк изобретения являтс я оздание высокоспецифи 1 сского и нрогого в техническом исполнении спообд определения изоферментд лакдтдгид(ни енззы (ЛДГ) -1 в сыворотке крови.Способ оущтвляется следующим образом.Пред.,гс мыи нооб спрд.ния и сыворотке крови ловк изофс рментз ЛДГоснован на ипольонаии 1 роогицских антител, по.уцс нных к оотнетствуоцему изоферменту ЛДГ свиньи. Способ заключается в удалении с помощью дтитл к М-субъелини пам чтьрех и оформ,1 ДГ, содержащих М-убъединицы, и измренин активностиосгднцгося в гелирумой сыворотке изофрмента ЛДГ, который и содержит в своем сотдв М-убъединиц.С це,ьк 11 с к пино о хддлния оордзх к. щегося илмлннгс ьомплкд зпител, полученных к соотвстствующему изоферменту ЛДГ виньи, содржапили М-убъединицы изоформдми .1,1,Г знтитс.лд пр.дв;ритсльно связывают с нрс 1 воримым носителем. В качестие тврдофззной оспвы иснсльзукт убитые к;ц тки",(д ру(оосси з н ге ив, содержа щи в сств своей бактериальной стенки белок А. Исгочниксл антител для получения тафилококкового иммуносорбента служит гетрологицеская днисыворотка кролика, шлучиная в результате иммунизации животного изоферментом ЛДГ -5 свиньи, содрждцим только М-хбьединиць.Способ включает че 1 ыр стадии: опрд. ление обшей ферментативной дк; инноти ЛДГ в тетируемой проб; сбработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с цлью связывания четырех изоферментов:,1 ДГ, ЛДГ-З, ЛДГи ЛДГ; уддлени стафилококкового иммуносорбента со связднными изоформами ЛДГ пнтрифуировднием; определение осгатоцной ферментативной активности ЛДГ, соответствуюцей активности изоферментд ЛДГ.Первая и четвертая стадии днализа проводятся с использованием общепринятых методик определения ферментативной активности ЛДГ.Предлагаемый способ характеризуется высокой специфичностью, поскольку имеет место количественное отделение определяемого изофермента ЛДГот четырех остальных. Полнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофорезз в агарозе образцов сыворотки, взяты до и после обработоки ее стафилококковым иммуносорбентом.Пример 1. Определение изофер мента ЛДГ -1 в сыворотке крови целовека.А Определени общей фсрмснтзтивнои активности ЛДГ в тестируемой сыворотке.Общую активность ЛДГ в тестируемых пробах определяли с помощью известного колори метрического метода. Образующийся в результате ферментативной реакции окисления лактата в пируват НАД.Н через промежуточный переносчик электронов феназинметосульфат восстанавливал соль тетразолия в окрашенный формазан, который определяли фотометрически. Величину оптической плотности растворов измеряли на колоримтре ФЭК - -56 М при длине волны 490 нм. Расчет активности ЛДГ в донорской сыворотке проводили по формуле:Обц 5 ктивность,(ДГ.,А -А, Г(Е,л)5где А оптическая плотность пробы, содержащей тестируемую сыворотку",А оптическая плотность слепого опытак пробе, одржащей сыворотку;А оптическая плотность пробы, в которую вместо сыворотки добавленэталонный раствор;А, - , опицсскдя плотность слепого опыта(к пробе, содержащей эталонный раствор);с) активность,1 ДГ в эталонном растворс (200 Е/л) .Ь. Обработка пробы стафилококковымиммуносорбентом, содержащим антитела к М-субьединицам ЛДГ.В пробирки с набухшим в фосфатно-солевом буфере стафилококковым иммуносорбетом, взятым из рдсчега 70 мг сухого веса бдктериальных клеток на одну пробирку, добавляли 80 мкл тестируемой сыворотки.Соотношение об ьем сыворотки (мкл) - сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) равно 1,14:1. Пробы тщательно пере.)мешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре.Стафилококковый иммуносорбент предтдвляет собой убитые клетки 5 гар)у 1 ососсцв ангесз, содержащие в составе своей бакте риальной стенки белок А с сорбированными на этом белке моноспецифическими иммуноглобулинами с к М-субъединицам ЛДГ.Моноспецифические антитела получены в результате иммунизаци кроликов гомогенным препаратом ЛДГ 5 свиньи и последующей очистки антисыворотки.В. Удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными изоферментами ЛДГРазделение оставшегося в растворе изофермента ЛДГ, не содержащего М-субъединицы, и связавшихся со стафилококковым иммуносорбентом изоформ ЛДГ, содержащих в своем составе от одной до четырех М-субьединиц (ЛДГ - 2, ЛДГ 3, ЛДГ - 4, ,1 ДГ - 5), проводили центрифугированием проб на центрифуге ЦУМ - 1 со скоростью 55 6000 об/мин при комнатной температуре втечение 1 О мин.Г. Определение остаточной ферментативной активности ЛДГ.

Смотреть

Заявка

4119567, 23.06.1986

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ АМН СССР, МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. Н. И. ПИРОГОВА, ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ВРАЧЕЙ, ВСЕСОЮЗНЫЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АМН СССР, ЛЕНИНГРАДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. ПАСТЕРА

РАШКОВЕЦКИЙ ЛЕОНИД ГРИГОРЬЕВИЧ, ГОНЧАР НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА, ЗАСЛАВСКАЯ НАТАЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА, ПРОЗОРОВСКИЙ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ, КОРОВКИН БОРИС ФЕДОРОВИЧ, ЦИРКИНА АЛЛА СЕРГЕЕВНА, МОРОЗОВА ВИКТОРИЯ ТАЗАРЕТОВНА, КРИВОНОСОВ СТАНИСЛАВ КОНСТАНТИНОВИЧ, ТАТАРИНОВ ЮРИЙ СЕМЕНОВИЧ, ЧЕРНЯДЬЕВА ИРИНА ФЕДОРОВНА, ТИТОВ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ, КЛЕГАНОВ ВЛАДИМИР КОНСТАНТИНОВИЧ, НОСКОВ ФРИДРИХ САВЕЛЬЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: G01N 33/49

Метки: изофермента, крови, лактатдегидрогеназы-1, сыворотке

Опубликовано: 30.04.1988

Код ссылки

<a href="https://patents.su/3-1392508-sposob-opredeleniya-izofermenta-laktatdegidrogenazy-1-v-syvorotke-krovi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-1 в сыворотке крови</a>

Похожие патенты