Способ определения изофермента лактатдегидрогеназы-1 в сыворотке крови

,О к ЕТЕНИ 6/Щя р ТВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ САНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР, Центральный институт усовершенствования врачей, 2-й Московский медицинский институт им. Н. И. Пирогова, Всесоюзный кардиологический научный центр АМН ГССР и Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ 11 ИЯ 1 ЗОФЕ 1. МЕНТА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫВ СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к иммунологии и медицинской бпохпмпп. Цель пзоб. рстсппясоздание пыеокоепсцифичноп и проетогс в техппческом исполнении способа определения пзофермспта лактатдсгидрогспазы (ЛДГ1 в сыворотке крови. Для этого используют гетсрологические антитела, полученные к соотнстствуощему изофермснту ЛДГ свиньи. Удаляют с помощью ангител к М-субъединицам 4 изоформы ЛДГ. содержащие М-субъсдиницы, и измеряют активность оставшегося в тсстируемой сыворотке изофермента ЛДГ - 1, который не содержит в своем составе М-субьединиц. Способ включает 4 стадии: определение общей ферментативной активности ЛДГ в тестируемой пробе; обработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с целью связывания 4 изоферментов: ЛДГ; ЛДГ; ЛДГи ЛДГ; удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными формами ЛДГ центрифугированием; определение остаточной фермснтативной активности ЛДГ, соответствующей активности изофермента ЛДГГ 1 олнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными элсктрофореза в агарозе образцов сыворотки, взятых до и после обработки ее стафилококковым иммуносорбентом.Изобретснис стноситс к илмунологии и медицинской биохимииЦельк изобретения являтс я оздание высокоспецифи 1 сского и нрогого в техническом исполнении спообд определения изоферментд лакдтдгид(ни енззы (ЛДГ) -1 в сыворотке крови.Способ оущтвляется следующим образом.Пред.,гс мыи нооб спрд.ния и сыворотке крови ловк изофс рментз ЛДГоснован на ипольонаии 1 роогицских антител, по.уцс нных к оотнетствуоцему изоферменту ЛДГ свиньи. Способ заключается в удалении с помощью дтитл к М-субъелини пам чтьрех и оформ,1 ДГ, содержащих М-убъединицы, и измренин активностиосгднцгося в гелирумой сыворотке изофрмента ЛДГ, который и содержит в своем сотдв М-убъединиц.С це,ьк 11 с к пино о хддлния оордзх к. щегося илмлннгс ьомплкд зпител, полученных к соотвстствующему изоферменту ЛДГ виньи, содржапили М-убъединицы изоформдми .1,1,Г знтитс.лд пр.дв;ритсльно связывают с нрс 1 воримым носителем. В качестие тврдофззной оспвы иснсльзукт убитые к;ц тки",(д ру(оосси з н ге ив, содержа щи в сств своей бактериальной стенки белок А. Исгочниксл антител для получения тафилококкового иммуносорбента служит гетрологицеская днисыворотка кролика, шлучиная в результате иммунизации животного изоферментом ЛДГ -5 свиньи, содрждцим только М-хбьединиць.Способ включает че 1 ыр стадии: опрд. ление обшей ферментативной дк; инноти ЛДГ в тетируемой проб; сбработка пробы стафилококковым иммуносорбентом с цлью связывания четырех изоферментов:,1 ДГ, ЛДГ-З, ЛДГи ЛДГ; уддлени стафилококкового иммуносорбента со связднными изоформами ЛДГ пнтрифуировднием; определение осгатоцной ферментативной активности ЛДГ, соответствуюцей активности изоферментд ЛДГ.Первая и четвертая стадии днализа проводятся с использованием общепринятых методик определения ферментативной активности ЛДГ.Предлагаемый способ характеризуется высокой специфичностью, поскольку имеет место количественное отделение определяемого изофермента ЛДГот четырех остальных. Полнота разделения изоформ ЛДГ подтверждается данными электрофорезз в агарозе образцов сыворотки, взяты до и после обработоки ее стафилококковым иммуносорбентом.Пример 1. Определение изофер мента ЛДГ -1 в сыворотке крови целовека.А Определени общей фсрмснтзтивнои активности ЛДГ в тестируемой сыворотке.Общую активность ЛДГ в тестируемых пробах определяли с помощью известного колори метрического метода. Образующийся в результате ферментативной реакции окисления лактата в пируват НАД.Н через промежуточный переносчик электронов феназинметосульфат восстанавливал соль тетразолия в окрашенный формазан, который определяли фотометрически. Величину оптической плотности растворов измеряли на колоримтре ФЭК - -56 М при длине волны 490 нм. Расчет активности ЛДГ в донорской сыворотке проводили по формуле:Обц 5 ктивность,(ДГ.,А -А, Г(Е,л)5где А оптическая плотность пробы, содержащей тестируемую сыворотку",А оптическая плотность слепого опытак пробе, одржащей сыворотку;А оптическая плотность пробы, в которую вместо сыворотки добавленэталонный раствор;А, - , опицсскдя плотность слепого опыта(к пробе, содержащей эталонный раствор);с) активность,1 ДГ в эталонном растворс (200 Е/л) .Ь. Обработка пробы стафилококковымиммуносорбентом, содержащим антитела к М-субьединицам ЛДГ.В пробирки с набухшим в фосфатно-солевом буфере стафилококковым иммуносорбетом, взятым из рдсчега 70 мг сухого веса бдктериальных клеток на одну пробирку, добавляли 80 мкл тестируемой сыворотки.Соотношение об ьем сыворотки (мкл) - сухой вес стафилококкового иммуносорбента (мг) равно 1,14:1. Пробы тщательно пере.)мешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре.Стафилококковый иммуносорбент предтдвляет собой убитые клетки 5 гар)у 1 ососсцв ангесз, содержащие в составе своей бакте риальной стенки белок А с сорбированными на этом белке моноспецифическими иммуноглобулинами с к М-субъединицам ЛДГ.Моноспецифические антитела получены в результате иммунизаци кроликов гомогенным препаратом ЛДГ 5 свиньи и последующей очистки антисыворотки.В. Удаление стафилококкового иммуносорбента со связанными изоферментами ЛДГРазделение оставшегося в растворе изофермента ЛДГ, не содержащего М-субъединицы, и связавшихся со стафилококковым иммуносорбентом изоформ ЛДГ, содержащих в своем составе от одной до четырех М-субьединиц (ЛДГ - 2, ЛДГ 3, ЛДГ - 4, ,1 ДГ - 5), проводили центрифугированием проб на центрифуге ЦУМ - 1 со скоростью 55 6000 об/мин при комнатной температуре втечение 1 О мин.Г. Определение остаточной ферментативной активности ЛДГ.