Способ получения иммобилизованной уреазы

(51) 4 М 11/ ЕНИ ОВАНСССР1982.бцияССР.Се ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОПИСАНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(7 1) физико-химический институтим. А.В, Богатского и Институт зклогической генетики АН МССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗНОЙ УРЕАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано прполучении иммобилизованной уреазы.Цель изобретения - увеличение стабильности иммобилизованной уреазыпри хранении. Способ заключается втом, что к иммобилиэованной на окисленном угле СКНО уреазы из БТарЬУ 1 ососсцз ааргорЬУСдсцз добавляют 4-5 кратный по отношению к белку фермента избыток капсикоэида или мелонгозида. Гликозиды, адсорбированные наугле, стабилизируют фермент, которыйне теряет активности при хранении втечение 5 мес. 1 табл.Изобретение относится к биотехнологии, касается иммобилизации уреазы и может быть использовано при определенин мочевины. Цель изобретения - увеличение стабильности иммобилизованной уреазы при хранении.Способ заключается в том, что киммобилизованной на углях СКН, уреаэе из БТарЬУ 1 ососсцэ эаргорЬУСдсцэдобавляют стероидные гликоэиды -капсикозид или мелангозид в 4-5-кратном по отношению к белку ферментавесовом избытке, На нативную уреазу 15гликоэиды не оказывают стабилизирующего действия, тогда как у иммобилиэованной уреазы в их присутствии увеличивается стабильность при хранении,Вероятно, адсорбированные на угляхгликоэиды изменяют микроокружениеуреазы, что приводит к стабилизациифермента. При хранении полученногопо предлагаемому способу препаратауреазы в течение 87-153 дней не происходит потери активности, тогда какв отсутствие гликозидов активностьферментов полностью исчезает,Способ иллюстрируется следующимипримерами. 30П р и м е р 1. Способ иммобилизации уреазы на углях СКН, осуществляется следующим образом. Смесь уреазы в буфере (0,06 М Иа-фосфатномрН 6,8) при ОС перемешивают на шут 35теле с чглем СКН Затем многократной промывкой полученного препаратаудаляют неадсорбировавшуюся уреазу.К 100 мл иммобилиэонанной на угляхСКН Уреазе иэ БарЬУ 1 ососсцэ эаргорЬуСсцэ (активность 60 ед/г) добавляют 5 мг капсикозида (соотношениебелок уреазы:капсикозид 1:5, см.таблицу У 1) в 2 мл 0,06 М Иа-фосфатногобуфера, рН 6,8 и 300 мг азида натрия,45Плотно закрытые колбы помещают в холодильник (3-4 С). Через 87 и 153 сутв отобранных пробах определяют уреазную активность и сопоставляют ее сисходной активностью. Уреаэную активность определяют при 37 С, инкубируяв течение 30 мин при встряхивании20 мг иммобилизованной уреаэы с 0,5 мл37-ного раствора мочевины в 0,5 мл0,06 М фосфатного буфера, рН 6,8.За единицу активности принимают такое количество белка фермента, которое катализирует образование 1 мкмольаммиака эа 1 мин при 37 С. Через 87 сут хранелия сохраняется 1147. исходной активности, а через 153 сут -1507 т.е. наблюдается повышениеактивности исходной уреазы,П р и м е р 2. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1.Только в качестве гликозида используется мелонгозид (таблица В 1). Через 87 и 153 сут хранения сохранялось1003 исходной активности.П р и м е р ы 3 и 4. Порядок выполнения операций аналогичен примеру1. Только соотношение белок уреазы:гликозид 1:4 (таблица У 2),П р и м е р ы 5-8Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1Только соотношение белок уреазы:гликозид 1;3, 1:6 (таблица У 3 и У 4),Примеры иллюстрируют нецелесообразность осуществления способа при данном соотношении.П р и м е р ы 9-12. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1. Только активность иммобилизованной на углях СКНО уреаэы 40 ед/гносителя, соотношение белок уреазы:гликозид 1;5, 1:4 (таблица У 5 иР 6).П р и м е р ы 13-16. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1, Только активность иммобилиэованной на углях СКН уреазы 40 ед/гносителя, соотношение белок уреазы:гликозид 1:3, 1:6 (таблица М 7 и 8).Примеры иллюстрируют нецелесообразность осуществления способа при данном соотношении.Г 1 р и м е р ы 17-20. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1. Только активность иммобилизованной на углях СКНО уреаэы 30 и70 ед/г носителя (таблица У 9 и 10).Примеры иллюстрируют нецелесообразность осуществления способа при данной активности иммобилизованного препарата.Результаты сведены в таблицу.Таким образом, предлагаемый способполучения иммобилизованной на угляхСКН, уреаэы позволяет получить препарат, сохраняющий при хранении в течение 153 сут 1007. исходной активностипри использовании мелонгозида и увеличить активность до 1507 при использовании капсикозида, тогда как в известном способе эа такой срок хранения активность уреаэы снижается донулевых значений. Увеличение сроков1373730 Способ получения иммобилиэованной уреазы, заключающийся в связывании уреазы, выделенной из ЯСарпу 1 о 1 О Активность уреаэы при хранении, Х от исходного Хранение,сутСоотношениебелок уреаэы: гликоНомер по порядку Контроль Капсикозид Мелонгоэид эид 100 114 100 87 1:5 60 100 150 1:4 153 60 100 110 100 87 90 140 153 100 100 100 87 1:3 60 19 25 153 44 36 100 87 1:6 60 21 25 153 100 110 100 1:5 40 100 136 153 100 110 100 1:4 40 85 140 153 100 100 100 87 1:3 40 0 24 27 153 50 46 100 87 1:6 40 24 153 32 100 100 100 87 30 62 53 50 153 65 56 18 87 1:5 10 20 31 153 Составитель В. Муромец Редактор М.Недолуженко Техред Л.0 лийиык Корректор Л. ПилипенкоЗаказ 536/20 Тирах 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 хранения позволяет эффективно испольэовать препарат уреазы в биотехнологии. Формула изобретения5 Активностьиммобилизованной науглях СКНуреазы соссцз варгорЬуТсив,с окисленным углем СКН о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью увеличения стабильности целевого продукта при хранении,после связывания уреазы с углем кполученному препарату добавляют капсикозид или мелонгозид в 4-5-кратномизбытке по отношению к количествубелка уреаэы по массе.