Способ определения мембранотропной активности полиеновых антибиотиков

СО 103 СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4 С 01 И 33/48 ОБРЕТЕН ИСАНИ ЬСТВ 28-14 Бюл, Уеский цесумов и088.8)е свидет601 Б тр АН АЗССРМБРАНОАНТИ(54)(57) СПОСОБ О ТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ БИОТИКОВ, включа бислойной липидно стии в тефлоновой РЕДЕЛЕНИЯ МЕ ПОЛИЕНОВЫХющий формирова мембраны на ячейке, расп от ед ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИ(21) 3516981 (22) 02.11.8 (46) 07.058 (71) Биологи (72) Х.М.А.К (53) 616,07 (56) Ав тор ск Ф 972400, кл ЯО 1229692 А 1 ляющем водно-солевые растворы, введение в раствор исследуемого антибиотика и измерение электропроводимости мембраны, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и специфичности способа, дополнительно определяют динамику времени релаксации потенциала мембраны, вычисляют постоянную времени релаксации и при увеличении электропроводимости мемб" раны более чем на 307 и повышении постоянной времени релаксации в сравненииРс,исходным определяют мембранную активность антибиотика.Изобретение относится к биохимиии биофизике и может быть использовано в фармакологии, микробиологии иэкспериментальной медицине.Цель изобретения - повышение точности оценки биологической эффективности при моделировании биологического действия мембранотропного вещества на искусственной бимолекулярной липидной мембране (БЛИ).Способ осуществляется следующимобразам.Формируют бислойную липиднуюмембрану на отверстии в тефлоновойячейке, разделяющем водно-солевыерастворы, вводят в нее исследуемоевещество и измеряют индуцированнуюпроводимость. После достижения стационарной проводимости отмывают исследуемое вещество из одного из растворов, регистрируют кинетику релаксации проводимости, определяют постоянную времени релаксации и поее величине определяют эффективностьисследуемого вещества 1 п чача.П р и м е р. Измерение электрических характеристик мембраны проводят в режиме фиксации потенциалас помощью усилителя 45-9,Напряжение Цот источника регулируемого напряжения подается черезэлектрод на мембрану, Ток через мембрану подается через экранированный1 электрод на вход злектрометрическогоусилителя, где преобразуется в сигнал выходного напряжения Цщщ.Ток вычисляется по формулеПвьиКасгде К - сопротивление обратной связи,Удельная проводимость вычисляетсяпо формулец еьхз11 вгде Б - площадь мембраны,Сигнал выходного напряжения усилителя подается на самописец и регистрируется на диаграммной ленте, Четырехканальный перистальтический насосподает по трубке отмывочный раствор,содержащий сахарозу, ко дну стеклянной кюветы (объем 12 мл), Пегкий исходный раствор отсасывается сверху.В результате происходит замена исходного раствора с антибиотиком раствором, не содержащим антибиотик, Приэтом условия в тефлоновой ,ячейке(объем 1 мл) неизменны, После прохаж 5 10 15 Щ 25 ЗО Э 40 Д дения границы раздела растворов через мембрану концентрация антибиотика во внешнем (отмываемом) растворе скачком падает до нуля. Моментпрохождения фиксируется визуально,так как растворы имеют разную плотность и разный показатель преломления Если подавать тяжелый атмывочный раствор сверху, то происходитперемешивание растворов, концентрация антибиотика вблизи мембраны меняется сложным нерегулярным образом,чта приводит к искажению кинетикирелаксации и неопределенности с.Состав мембраны фосфолипиды/холестерин .= 0,5. Солевой раствор 10 ммКС 1 рН 6,= 23 С. Вводят 1,7 10метамфоцина. После достижения стационарной проводимости отмывают внешнююсторону мембраны раствором 10 мм КС 1 ++ 10% сахарозы,Иембрану формируют следующим образомНа отверстие вымытой и высушеннойячейки наносят каплю липидного раствора и высушивают. Это необходимодля лучшего сцепления мембраны с краями отверстия, Затем ячейку вставляютв стеклянную кювету, заливают солевьими растворами и пад контролем в микроскоп (ИСС 2) из пипетки, смоченнойлипидным раствором, выдувают на отверстии пузырек воздуха, Первоначальнолипидная пленка на отверстии имеетзначительную толщину и на ней в отраженном свете в микроскоп видна интерференционная картина (Кольца Ньютона.). По мере утаньшения пленки (растекания) ее толщина становится меньше длины волны, и интерференционная,картина исчезает. Из маточного раствора антибиотика 10 Э М в ДИСО илидистиллированной воде вводят в солевые растворы в требуемом количествемикрошприцом и перемешивают магнитной мешалкой, Регистрируют кинетикупроводимости и после достижения ее стационарного уровня в производят отмывку. Момент начала отмывки регист - рируют визуально в микроскоп. Регистрируют кинетику релаксации проводимости и строят график в координатах 1 ц ц/в 1, причем началу отсчета времени соответствует момент начала отмывки,Для определения с на линейном участке графика могут быть выбраны произвольные моменты времени1229 Для сравнения эффективности различных антибиотиков дпя мембран сос. тава холестерин/фосфолипиды щ 0,5 и концентраций амфотерицина Вц и его аналога АВ 4 (условное название) 5 10 М определяют с 2 ч и Гщ 8- 1 О мин соответственно. Составитель Н.КузенковаРедактор А,Козориз Техред Л.Олейник Корректор А.Ференц Заказ 2446/45 Тираж 778 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 н С, с, = 24 мин, с 30 мин, 1 К К/К = О, 84 взяты г.ля конкретного варианта расчета.Как известно из аналитической геометрии, уравнение прямой у=ах + Ъ, 5 где а - тангенс угла наклона прямой.Пусть заданы две точки прямойу) э (хг у )Тогдау,=ах,+Ьу ах +Ьготкудау - 7 / х - ха ="г х уг уРелаксация проводимости описывает 15 ся уравнением1 с КЯГ 1или1 К К/Кз = 1 К 1 с - с/с,т.е. получают линейную зависимость с угловым коэфициентом - 1 СОтсюда и следует формула для определения 7:л 1 г - Св аь252,3 1 К К 1/КВеличину 1 К К/Кг= 0,84 получают из 692 4графика 1 К К(С)/Кз при й24 мин,- 30 мин.Отсюда получают30 - 24- = 3 мин.2,3 0,84Таким же образом по кинетическимкривым определяются все остальныезначения Г,Повторяют указанную процедуру в-1диапазоне концентраций 5-10 -3 10 М.Для сравнения эффективности анти.биотнка мембраны животных клеток моделируют составом холестерин/фосфолипиды в весовом соотношении 1:2,а клетки грибов - эргостерин/фосфолипиды 1:20. При этом получают 7 -,5 мини ) 30 мин при концентрации метамфоцина 10М.