Способ определения концентрации аминофосфолипидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 1 М 33/48 3 рр; ;,3,Бйо ГС ОПИСА ЗОБРЕТЕНИЯ ни,и,ас.- си. е ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Тбилисский ордена Трудовогоного Знамени государственный унивтет(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕРАЦИИ АМИНОФОСФОЛИПИДОВ путем выд иия Фракции липидов из биологическоиткани, растворения их в органическомрастворителе, добавления нингидрина,инкубации реакционной смеси с последующим Фотоколориметрированием водной Фазы, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точностиспособа, липиды растворяют в четыреххлористом углероде, нипгидрин добавляют в конечной концентрации 610 мг/мл, в реакционную смесь дополнительно вводят 1 М хлористый кальций при соотношении хлористого кальция и реакционной смеси 1:1 с последующим отделением водной Фазы.2Лродолиеиие табл. 1 1 7 33 1 5 2б Определениеконцентрацииаминофосфолипидов (предлагаемый) 3,8 63,2 Таблица 2 Конечная Ошибкаопыта, Е Полученное количество концентрация нингидрина, мкг липида, мкг 61,6 5,3 6,0 63,2 3,8 8,0 10,0 62,1 Таблица 3 МолярностьСас липида, мкг 0,5 22,5 50,2,63,2 1,0 3,8 63,2 1,5 3,8 Таблица 4 Соотношение 1 М СаС 12 и раствора ли- пида Полученное количество Ошибкаопыта, 7 липида, мкг 3,8 3,8 6,1 1:0,91:11:121 63., 2 63,2 61,0 Определениес помощью нингидринового реактива (известный) 55 6,4 и Изобретение относится к биохимиии может быть использовано при биохимиче ском анализе фо сфолипидов в биологической ткани .Целью изобретения является повыше - 5, ние точности способа,П р и м е р , Липиды из биологической ткани экстра гируют 20-кратнымобъемом смеси хлороформ - метаноли ри соотношении 2 :, дв а раза сме-0сью при соотношении 1 :и затем о садо к заливают этой же смесью ( 1 :,)и оставляют на ночь . На следующийдень экстр акцию липидов проводятдважды смесью хлороформ - метанол5при соотношении 2 фОбъединенныелипидные экстракты отмывают о т водорастворимых примесей охлажденнымраствором О, 3 И БаС 1 , добавляемымс таким расчетом, чтобы верхний20водный слой содержал не более 50 Еспирта (во избежание извлеченияфосфолипидов) , После центрифугиров ания верхний водора ств оримый слойотсасывают . Пленку, образующуюс я 25на поверхности разделка двух фаз( хлороформенной и водно-спиртовой),растворяют добавлением небольшогоколичества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фо с- -ЗОфолипиды , упаривают под вакуумомдосуха при комнатной температуре ,Общее количество липидов определяютвесовым методом , сухой остатокр аствор яют в органическом рас тв о 35рителе - четыреххлористом углероде(СС 11) из расчета раствора на 1-3 мглипидовПроцесс выделения липидов и определения в них концентрации аминофосВфолипидов проводят при стандартныхусловиях (комнатная температура18-20 фС, давление 760 мм рт.ст )в течение 40-50 мин,1 Таблица 1 ПолученноеОшибкаколичество опыта, 7. К фосфолипидам, растворенным в 4 мл СС 11, дббавляют нингидрин в конечной концентрации 8 мт /мл липид- . ного раствора. Инкубацию проводят при 60 С в течение 10 мин. Раствор фильтруют. Для извлечения из СС 1,1 образовавшегося розоватого комплекса добавЛяют 4 мл водного раствора 1 М СаС , Смесь взбалтывают и оставляют до полного разделения водной и органической фаз в течение 30 мин.Измеряют интенсивность поглощения перешедшего в водную фазу комплекса пр длине волны 403 нм и определяют3 11 количество аминофосфолипидов по стандартной кривой. Стандартная кривая строится по известным концентрациям фосфатидилзтаноламина.В табл, 1 приведены данные определения заданного например, 65 мкг) количества аминофосфолипидов - фосфатидилэтаноламина известным и предлагаемым способами.В табл. 2, 3 и 4 приведены данные определения заданного (например,7331565 мкг)количества фосфатпдилэтанолампна при различных значениях концентраций нингидрина и при извлечении комплекса при различных значенияхмолярности и объема СаС 1 соответственно. Как видно из таблиц, использованиеспособа позволяет повысить точность 1 О определения концентрации аминофосфолипидов.Составитель Е. ЖитпиковаРедактор Л, Веселовская Техред Л.Иикеш Корректор В, ГирпякЗаказ 5044/43 Тираж 897 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушскал наб д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4