Способ титрования энтомопатогенных вирусов

(% ОИ р С 1207/О САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СТВ Н АВТОРСН С ВИДЕП:"Л АНИЯ ЭНТОГО(54 ТОГ жен лиз ю щ шен чающий вирусо з(46) (72) и И. (71) .и ге (53) ана ч т енко с целью повы ярной биологиикой ССР) ара ода знаку ых кл ле о вирусов дляекомыми и переЖенева, Изд-во Ч. ег а 1. АгсЬ, Кф 4, р.347-349 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС Пб ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(22) 03.098223,07,84, Бюл. УС.В. КомиссарН. СкуратовскаяИнститут молекулнетики АН Украинс632.937. 16(088.8(57) СПОСОБ ТИТРО ННЫХ ВИРУСОВ, вкл е культуры клеток зараженных клеток и й с я тем, что, я точности, анали ок проводят по пр я деления зараженИзобретение относится к способамколичественного определения инфекционности вирусов, применяемых для би)ологической борьбы с насекомыми-вредителями лесов и сельскохозяйственных культур,Согласно рекомендации ВОЗ, в качестве биоинсектицидов для насекомых - вредителей выбрана группа ба"куловирусов Я .10Важнейшей характеристикой биоин"сектицидов как вирусных препаратовявляется их инфекционность, поэтому актуальная разработка методовопределения инфекционности такихпрепаратов. Инфекционность вирусных препаратов определяют на насекомых и на перевиваемых культурах клеток насекомых, которые в последниегоды получают все большее развитие,открывая возможности излучения вирусов в стандартных условиях. Приемы,используемые в работе с культурамиклеток насекомых, основаны на методах, ранее разработанных для культур клеток позвоночных,Известен способ титрования энтопатогенных вирусов, включающий заражение культуры клеток вирусом и ана"лиз зараженных клеток, например, побляшкам 2 .Однако положительный результаттитрования методом бляшек зависит от.многих факторов, например от качест"ва. питательных сред, посуды, физиоло 35гического состояния культуры, кото"рое не всегда позволяет получить хороший монослой. Основное условие припостановке метода бляшек - заданныесроки и. необходимое количество. Кроме40того, постановка метода бляшек обу"словливается использованием дорогостоящей импортной агарозы, что затрудняет применение метода в широкоммасштабе.45Титрование по бляшкам не применимо также и для тех вирусов ядерного полиэдроза, которые не образуютбляшки в чувствительной культуре, атакже в тех случаях, когда чувствительная культура находится в суспензионном или полусуспензионном состоянии.При изучении культуры клеток насекомых, зараженной вирусом ядерного полиэдроза, установлено подавление 55 синтеза клеточной ДНК в сравнении с незараженными культурами, что сопро вождается подавлением роста клеток. Целью изобретения является повышение точности способа титрованияэнтомопатогенных вирусов.Цель достигается тем, что анализзараженных клеток проводят по признаку подавления деления зараженныхклеток,П р и м е р. Для титрования готовили десятикратные разведения исходного вирусного материала, представляющего собой культуральную жидкость,содержащую внеклеточный свободныйвирус ядерного полиэдроза тутовогошелкопряда, полученный из культурыклеток непарного шелкопряда БС 1.д,зараженных вирусом ядерного полиэдроза тутового шелкопряда. Разведенияготовили на свежей питательной среде.Затем по 0,2 мл каждого разведениявносили в пробирки, На разведениебрали по четыре пробирки. По 0,2 млпитательной среды вносили и в четыреконтрольные пробирки. Готовили клеточную суспензию и по 0,8 мл вносили впробирки с разведенным вирусным материалом. Суспензию готовили с такимрасчетом, чтобы в каждую пробирку попадало одинаковое количество клеток(1-3 105 клеток/мл), Не сливая вирус,пробирки инкубировали в термостатепри 28 С в течение 10-12 дн. в опыотах с вирусом ядерного полиэдроза тутового шелкопряда, вирусом ядерногополиэдроза большой вощинной моли ивирусом ядерного полиэдроза непарногошелкопряда, На 7-й день отбирали подве пробирки каждого разведения вируса ядерного полиэдроза и учитывалиобщее количество клеток в каждойпробирке. Подсчет клеток производили в счетной камере Горяева с точностью + 1-3 10" клеток/мл. Учет наболее поздние сроки производили сцелью установления возможного прироста клеток в пробирках с низкой множественностью заражения. К этомувремени количество клеток в контрольной культуре увеличивалось в несколько раз,что обеспечивало более четкоеопределение разведения, дающее эффектподавления роста клеток. Результатыучета показали, что вирусосодержащииматериал в разведении 10 еще подавля ет рост клеток, тогда как разведение.10 таким эффектом не обладает. Концентрацию вируса выражали вусловных единицах подавления ростаклеток на 1 мл зараженной клеточ1104 155 етод титровани истем Титр по ПРКЕПРК/мл Титр по бляшк БОЕ/млКлетки БСЬ д 35 - вирусоза тутовог ядерного полиэшелкопряда 10 35 - вирусоза большой ки Б олиэдоли ядерног вощинно 2 10 Клетки 1 РЬ В = 65 ядерного нолиэдроз непарного шелкопря вирус 10 Составитель И. ТарееваТехред М. Гергель Редактор Н. Лжу ектор О. Била Заказ 5166/1 522 ого комитета СССРний и открытий Раушская наб., д. дписное 8 ТиражВНИИПИ Государственпо делам изобрете 113035, Москва, Ж,лиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,ной сус пензии - ЕПГК/мл, За единицуактивности принималось минимальноеколичество вирусосодержащего материала, которое еще вызывало подавлениероста клеток. Так, для вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопрядатитр составлял 10ЕПРК/мл. Сравнивали результаты титрования по ПРК сданными титрования по бляшкам. Титрвируса ядерного полиэдроэа тутовогоХшелкопряда по бляшкам составлял 4 10бляшкообразующих единицу на 1 мп. Таким образом, для данной системы; вирусядерного полиэдроза тутового шелкопряда - клетки непарного шелкопряда 15БСЬЙчувствительность титрованияпо ПРК примерно на порядок выше,чем по бляшкам,Аналогичные результаты полученыпри титровании вируса ядерного полиэдроза большой вощинной моли, вирусаядерного полиэдроза непарного шелкопряда. Для этих вирусов титрованиепо ПРК также оказалось более чувствительным, чем другими методами (см. таблицу). Сравнение чувствительных трех способов титрования вирусов ядерного полиэдроэа приведено в таб" лице.Поскольку вирус ядерного полиэд" роза непарного шелкопряда в культуре клеток непарного шелкопряда 1 РЬ Вйне образует бляшки, а полиэдры образуются только в единичных клет-г ках начальных разведений (10 - 1 О ), титр этого вируса ядерного полиэдроэа определяли только по методу ПРК.Результаты проведенных опытов вос" производимы для всех испытуемых систем. Из приведенных данных можно сделать вывод, что предлагаемый спо" соб титрования,энтопатогенных виру" сов в культуре клеток насекомых по" эволяет определить инфекционность широкого круга вирусов, т,е. всех тех вирусов, которые при размножении в культуре подавляют рост клеток, не вызывая их разрушения.